重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因对大脑皮层神经元缺氧保护作用的研究

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1、（《中国图书资料分类法》）分类号：R743.9单位代码：10660学号：S090251贵阳医学院2012届临床医学硕士专业学位材料(临床论文部分)重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因对大脑皮层神经元缺氧保护作用的研究研究生：邹哲华导到师：徐坚教授陶陶教授年年级：2009级专转业：神经病学2012年05月20日贵阳医学院2012届硕士研究生论文目录第一部分重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因抗大鼠大脑皮层神经元缺氧的研究摘要……………………………………..3-4缩略词表……………………………………5前言…………………………………….

2、.6材料与方法………………………………..7-10结果……………………………………..11-12讨论……………………………………..13-15结论……………………………………..16参考文献…………………………………..17-18实验附图……………………………………19-21英文摘要…………………………………..22-23第二部分Westernblot法定量检测AdHIF-1α及Ad转染缺氧神经元后各组神经元中HIF-1α、EPO及VEGF蛋白的表达摘要……………………………………..24缩略词表……………………………………25前言…

3、…………………………………..26材料与方法………………………………..27-32结果……………………………………..33-36讨论………………………………………37-38结论……………………………………..39-1-贵阳医学院2012届硕士研究生论文参考文献…………………………………..40实验附图…………………………………..41-42致谢……………………………………..43英文摘要…………………………………..44论文独创性声明…………………………....45综述…………………………………....46-50附：临床能力考核有关材

4、料：临床轮转考核表(按时间顺序)学术活动情况表(按时间顺序)临床能力考试及学位答辩情况表-2-贵阳医学院2012届硕士研究生论文重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因对大脑皮层神经元缺氧保护作用的研究专业神经病学研究生邹哲华导师徐坚教授陶陶教授第一部分重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因抗大脑皮层神经元缺氧的研究摘要目的探讨重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因对大鼠大脑皮质神经元缺氧后的保护作用，为临床治疗缺血缺氧性脑血管病提供更多的实验依据。方法制备大鼠大脑皮层神经元体外原代培养及缺氧的模型；倒置显微镜下观察正常和缺氧神经元的生

5、长情况；免疫细胞化学鉴定大鼠大脑皮层神经元；将带有绿色荧光蛋白（Greenfluorescenceprotein，GFP）的重组腺病毒介导的缺氧诱导因子-1α基因（Recombinantadenovirus-mediatedhypoxiainduciblefactor-1alphagene，AdHIF-1α）及重组腺病毒空载体（Recombinantadenovirusemptyvector，Ad）转染缺氧的神经元，并分5个时间点（12h，24h，48h，72h及96h）在荧光显微镜下观察AdHIF-1α及Ad的转染效率；将实验神经元

6、分为正常对照（Normoxia）组、缺氧（Hypoxia）组、AdHIF-1α转染组及Ad转染组，透射电镜下观察各实验组神经元超微结构的变化。结果（1）神经元的原代培养：初种神经元2h开始贴壁，48h后可见大部分细胞贴壁，细胞形态比较单一，呈圆球形，偶见细胞长出突起。第5天神经元中混杂有较多的胶质细胞，换N2培养液抑制杂质细胞的生长，培养至第11天，神经元生长旺盛，纯化率达95%以上。（2）免疫细胞化学鉴定：取培养至第11天的神经元，加入小鼠神经丝（Neurofilament，NF）抗体，二氨基联苯胺（Diaminobenzidine

7、，DAB）染色，光镜下NF阳性神经元的细胞质和突起呈棕色或棕褐色，细胞核深染，形态呈圆形、圆锥形，从胞体伸出突起，并与周围细胞连接，突起多为单极或双极，证实所培养的细胞为皮层神经元。（3）缺氧模型的建立：将用于实验的神经元换用含100μmol/LCoCl2及2%胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS）的DMEM培养液分别继续培养12h，24h，48h及72h，经过形态学观察和缺氧模型预实验，证实缺氧24h适合用作缺氧模型。（4）荧光显微镜下观察AdHIF-1α及Ad的转染效率：AdHIF-1α及Ad转染缺氧的神经元后，-3

8、-贵阳医学院2012届硕士研究生论文12h可见有少许荧光开始表达，24h荧光表达稍增加，48h荧光表达最明显，72h荧光表达下降，96h荧光表达微弱。（5）神经元超微结构变化的观察：透射电镜下Normoxia组神经元形态