缺氧诱导因子-1α对脑缺血缺氧性损伤治疗作用的分析

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1、研究论文缺氧诱导因子．1Q对脑缺血缺氧性损伤治疗作用的研究-●上--_■一刖吾脑卒d0(CerebralStroke)是最常见的神经系统致死性疾病，严重危害人类健康。其中，缺血性脑卒@(IschemicCerebralStroke)占脑卒中发病的绝大部分(约60．80％)，而且近年来其发病率呈上升趋势并逐渐年轻化，我国每年新发生脑卒中人数约150万人，重残者占40％以上。缺血性脑卒中的病理生理过程的本质是缺血缺氧性脑损伤，缺氧诱导因子．1(hypoxia．induciblefactor-1，HIF．1)作为一种转录调节因子，在此过程中起

2、着关键性的作用，其活性亚基HIF．10【在缺血缺氧性疾病中的作用也日益受到人们的重视。当细胞处于低氧条件时，HIF．1a降解受到抑制，稳定性增加，逐渐在胞浆中聚集并转移至胞核与HIF．1B结合形成完整并且有活性的HIF．1转录复合体。HIF．1则可与细胞核内DNA上的低氧反应元件结合，调控其下游上百种靶基因的转录。目前，急性溶栓是唯一被认可的一种对缺血性脑卒中有效的临床治疗手段，但是其较短的治疗时间窗限制了溶栓治疗的临床应用¨1。因此，找到一种新的行之有效的临床治疗手段，就显得尤为重要。大量研究表明，HIF．10【对于缺血缺氧性脑损伤具

3、有确切的神经保护和修复作用。我们前期研究中已经首次证实，经颈外．颈内动脉途径注射外源性重组HIF．1s质粒，此外源性质粒可直接在神经组织中表达，显著减少脑缺血梗死面积，诱导血管新生，促使星形胶质细胞、少突胶质细胞数量增加，并有效抑制小胶质细胞的增殖，同时可修复脉络丛血管内皮细胞的损伤，并显著上调其神经分泌功能，提高神经组织对缺氧的耐受性从而发挥神经保护作用。这为临床应用HIF一1Q基因治疗脑缺血缺氧性疾病提供至关重要的理论依据。1主要仪器设备1．1主要仪器设备材料与方法6研究论文手术显微镜手术显微器械电子天平微量加样吸头电热恒温水浴槽微

4、量加样器--80℃低温冰箱4。C低温冰箱制冰机去离子水仪PVDF膜(孔径为O．22lam)3MM滤纸医用X射线胶片通用显影粉、酸性定影粉高速离心机转移脱色摇床旋涡混匀器电泳仪低温离心机凝胶玻璃板、固定夹垂直电泳槽转移电泳槽2主要试剂及耗材水合氯醛4％多聚甲醛容液氯化．2，3，5三苯基四氮唑(TTC)中性戊二醛乙醇乙醚戊巴比妥钠磷酸二氢钠日本O1YmPuS宁波市成和器械厂德国Sartorius公司北京鼎国生物公司上海医用恒温设备厂Gilson公司，法国SANYO，日本青岛海尔冰箱股份有限公司AFl0SCOTSMAN，美国PALL，Pure

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6、羊)蛋白预染Marker(105KD)甲醇脱脂奶粉ECL发光液3实验动物SD大鼠(280--330克)4实验方法4．1O．1MPBS缓冲液的配制4．1．1储备液的配制4．1．1．10．2MA液的配制NaH2P046．24049双蒸水200ml4．1．1．20．2MB液的配制北京鼎国生物技术有限公司北京中山金桥生物技术有限公司北京泛基诺生物技术有限公司Genview，美国北京鼎国生物技术有限公司Sigma，美国SantaCruz，美国北京中山金桥生物技术有限公司Genview，美国北京化学试剂厂北京普利来Amersham，美国河北医科大学

7、试实验动物中心Na2HP0471．6289双蒸水．1000ml4．1．1．3O．1MPBS缓冲液的配制(PH7．2．7．4)O．2MA液47．5ml0．2MB液202．5mlNacl4591NNaOH10ml双蒸水4750ml研究论文将上述液体配好后4。C冰箱保存待用4．2HIF．1a质粒的构建及鉴定经过测序后，将体外合成HIF．1a的cDNA，克隆入真核表达载体pcDNA3．1，克隆片段大小：2．5kb；酶切鉴定重组子，根据需要进行体外扩增。4．3大鼠大脑中动脉脑缺血模型建立及质粒注射实验4．3．1实验动物分组健康成年雄性Wistar

8、大鼠75只，体重280．3309之间，自由进食水，在大约20℃室温环境下饲养。将大鼠随机分为两组：造模成功2h后，实验组大鼠25只进行HIF．1仅质粒注射，对照组25只注射PBS缓冲液，均按注射后时间不同分