盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备及其cielisa检测方法的建立

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1、分类号——UDC——学位论文学号丛Q里QZ主2密级——盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备及其CiELISA检测方法的建立指导教师姓名：申请学位级别：论文提交日期：学位授予单位：汪惠泽硕士2Q12生垒月扬刿盘堂答辩委员会主席：论文评阅人：学科专业名称：堕廛簦匡堂论文答辩日期：2Q12生鱼月学位授予日期：2012年5月扬州大学硕士学位论文ⅡIIIlllllIIIlllIllIIllIIIY2258787盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备及其CiELISA检测方法的建立PreparationofMonoclonalAntib

2、odiesagainstClenbuterolandtheEstabfishmentofanIndirectCompetitionELISAMethod研究生：汪惠泽导师：王捍东教授学科：临床兽医学M．S．Candidate：HuizeWangSupervisor：Prof．HandongWang扬州大学兽医学院临床兽医学教研室2012年5月中文摘要盐酸克伦特罗(Clenbuterol，CL)，是一种人工合成的B2．肾上腺素受体激动剂，与莱克多巴胺、沙丁胺醇等药物统称为“瘦肉精”。最初作为临床上支气管扩张剂

3、使用，防治支气管哮喘、慢性支气管炎等疾病，但由于其副作用较大而停止使用。CL具有改变肉畜体内营养物质重新分配的功能，减少脂肪的合成与积累，加快蛋白质的合成速度，从而改变畜肉品质。然而，肉畜食用高剂量的CL后会产生大量的残留，食用残留有CL的动物源性食品会对人体产生毒副作用，影响人体健康。因此，世界各国明令禁止将CL作为饲料添加剂使用，我国农业部也严令禁止使用。然而国内仍有非法者将之大量用于肉畜生产以牟取暴利。目前国内外已建立多种方法检测CL的残留，包括仪器分析法，如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(G

4、S)、气相色谱．质谱联用技术(GC．MS)；免疫学分析方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫测定法(CGIA)等。虽然色谱技术能准确、高效的检测CL的残留，但存在方法复杂、耗时长、技术要求高等问题且需要昂贵的仪器、专业的操作技能，不适合大批量样品的筛选。而ELISA方法可以解决这些问题，它是一种简单、准确、高效、廉价、特异的检测方法，适于大批量样品的快速筛选。本研究以单克隆抗体和酶联免疫吸附测定技术为基础，通过蛋白质连接技术合成CL人工抗原，研制出针对CL的单克隆抗体，建立检i贝s]CL残留的Ci

5、ELISA检测方法。1．CL人工抗原的合成与鉴定。通过重氮法将CL与载体蛋白(BSA、OVA)偶联，合成人工抗原CL．BSA、CL．OVA，通过紫外扫描和免疫学方法初步鉴定偶联成功。两种抗原CL．BSA、CL．OVA的结合比例分别为12：1和10：1。2．CL单抗的制备。通过对比实验，将CL．BSA作为免疫原，CL．OVA作为包被原。用CL．BSA常规免疫BALB／c小鼠，五免后血清效价达1：16000以上。通过杂交瘤技术和酶联免疫技术最后筛选获得3株能稳定分泌抗CL特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，其中一株细

6、胞8D2分泌的抗体对CL的表现出较强的结合能力，制备的腹水效价为1：120000，蛋白浓度为21．8mg／mL。3．ELISA检测方法的建立。利用8D2杂交瘤细胞制备的抗CL腹水建立检测CL残留的间接竞争ELISA方法。采用包被原最佳稀释浓度1：10000，腹水抗体的工作浓度1：60000，药物浓度在0．5-50ng／mL范围内得到标准曲线线性方程为：Y=一0．5015x+0．7438，相关系数R2=扬州大学硕士学位论文110．9919，IC50为2．15ng／mL，检测限低于0．5ng／mL，定量限为0．

7、97rig／mE。交叉实验表明，该单抗对CL表现出高度的特异性，与其他一些13．肾上腺素激动剂药物无交叉反应。4．添加回收实验。将建立的检钡I]CL的ELISA方法应用于猪肝脏组织的添加回收实验，样品经前处理后用于测定。当样品处理液作4倍以上稀释时，样品基质干扰基本消失。在0-50ng／mL范围内，曲线标准方程：Y=--0．4114x+0．7063，R2=0．9886，IC50为4．39ng／mL，LOD低于O．5ng／mL。用5、10、50ng／mL的盐酸克伦特罗标准液做添加回收实验，经检测肝脏药物回收率

8、在85％100％之间，批内差异在4．12％一6．71％之间，批间差异在5．08％～7．13％之间。关键词：盐酸克伦特罗；单克隆抗体；间接竞争ELISA；添加回收试验ABSTRACTIllABSTRACTClenbuterol(CL)isakindofp2一adrenrgicreceptoragonistwhichfirstisusedtotreatbronchialasthmaandchronicbronchit