基于kdr为靶点靶向超声微泡对肿瘤新生血管分子显像的研究

《基于kdr为靶点靶向超声微泡对肿瘤新生血管分子显像的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、硕士学位论文基于KDR为靶点的靶向超声微泡对肿瘤新生血管分子显像的研究硕士研究生：位红芹指导教师：李颖嘉教授摘要背景与目的：新生血管在肿瘤生长、侵袭和转移过程中起着重要作用，随着对肿瘤血管生成分子机制认识的逐渐深入，以肿瘤血管异质性为基础的血管功能性分子标记物不断开发，使以肿瘤新生血管为靶点的肿瘤分子成像成为可能。现有的超声造影剂粒径多在1-gum左右，诊断条件下难以透过血管壁的细胞间隙进入组织间质，是真正意义上的血池造影剂，与其它在分子水平用于评价肿瘤血管生成的影像学方法如CT、MⅪ，PET等比较，无造影剂外渗致背景信号增高的缺陷，造影增强信号完全来自于肿瘤血

2、管床，同时超声技术具有较好的空间分辨率和实时显像功能，操作简便，无辐射损伤，更适合用于肿瘤血管生成的研究。研究表明，在实体瘤发生的早期阶段已有血管生成开关的启动。KDR作为最重要的血管生长因子VEGF的主要受体，介导VEGF的内皮细胞增殖、迁移、血管通透性增加等促血管生成活性，在肿瘤血管生成过程尤其是早期阶段起着关键作用。本课题组前期的研究证实从人正常乳腺．单纯增生．非典型增生．乳腺原位癌．乳腺浸润性癌这一发生与演进过程中，KDR表达逐渐增高增强，尤其在乳腺原位癌及乳腺浸润性癌的血管内皮细胞呈持续高表达，表明以KDR为靶点进行乳腺癌新生血管分子显像可能为乳腺癌的

3、早期诊断提供新的思路。KDR高摘要表达于乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多种肿瘤新生血管内皮细胞，与肿瘤的发生与转移密切相关，提示KDR可能成为多种实体瘤新生血管特异性分子显像的靶标并用于评价肿瘤血管生成状态，估测预后及进一步用于抗血管生成治疗疗效监测。靶向超声分子显像在血栓、炎症、动脉粥样硬化以及肿瘤新生血管的评价方面已取得初步成果。目前与超声微泡连接用于超声分子显像的配体主要以抗体居多，抗体与靶细胞表面抗原结合特异性强，但抗体明显的免疫原性，分子量过大，受其表面修饰位点限制显像灵敏度不够高的缺陷限制了以抗体为导向分子的靶向造影剂在体内应用。因此，本实验中我们选择分子

4、量小，与靶点结合特异性强的短肽作为与超声造影剂结合的配体，将从噬菌体肽库中筛选到的与KDR有高亲和活性的12肽K237通过生物素．亲和素桥与脂质体微泡偶连，构建靶向微泡，体外实验鉴定其生物活性，同时建立裸鼠移植瘤模型进行超声造影显像，探讨以l①R为靶点进行乳腺癌新生血管分子靶向超声显像的可行性。材料与方法：1．短肽的合成．参照文献方法固相合成与KDR有高亲和活性的氨基酸序列为(HTMYYHHYQHHL)的生物素化十二肽以及含随机序列的对照肽，高效液相色谱法测定化学纯度，柱层析法进行纯化分离，收集主峰进行质谱分析。2．DiI红色荧光标记的靶向微泡的制备按摩尔比称取

5、一定量的DSPC、DPPE．Biot于三颈瓶中，并加入DiI染料、PEG4000、泊洛沙姆(F188)，加251Ill蒸馏水，于70℃水浴搅拌30rain，放冷至室温。把制好的脂质混悬液加入50ml聚丙烯管内，将剪切刀头插至液面下，通入全氟丙烷2min气体，以一定的剪切速度剪切一定时间，制得包裹全氟丙烷气体的脂质微泡，分装于西林瓶中充入全氟丙烷气体密闭，制备得到生物素化DiI红色荧光标记的脂质微泡。生物素化脂质微泡加入链亲和素，冰上孵育30min，纯化洗涤后再分别加入生物素化12肽或含随机序列的对照肽，冰上孵育30min，洗涤纯化后即制备出靶向微泡(MBp)和对

6、照微泡(MBc)，4"C冰箱保存。II硕士学位论文3．靶向微泡理化性质鉴定同上述步骤制备生物素化的DiI红色荧光标记的普通微泡，加入链亲和素，洗涤纯化后加入FITC标记的生物素化12肽，冰上孵育30min，洗涤纯化后即制备出FITC标记的靶向微泡(FITC—MBIo)。库尔特计数仪进行粒度分析，光镜及荧光显微镜观察微泡形态、荧光分布，荧光显微镜下观察FITC绿色荧光标记的小肽与DiI红色荧光标记的微泡的连接情况。4．靶向微泡体外靶向试验4．1．体外靶向试验：细胞免疫荧光及WesternBlot检测人结肠癌癌LOVO细胞、人乳腺癌MDA．MB．231细胞、入结肠癌

7、LSl74T细胞KDR表达情况，DiI标记的靶向微泡(MBp)及DiI标记的对照微泡(MBc)分别与三种细胞孵育30min，DAPI染核后，普通光镜及荧光显微镜下观察微泡与三种细胞的粘附情况，取10个随机视野，计数每个视野内平均每个细胞周围粘附的微泡数量，比较三种细胞周围粘附的微泡数量的差异。4．2．阻断试验：将一定量的K237与LOVO细胞孵育30min后滴加DiI标记的靶向微泡(MBp)，DAPI染核后，普通光镜及荧光显微镜下观察微泡与LOVO细胞的粘附情况，取lO个随机视野，计数每个视野内平均每个细胞周围粘附的微泡数量，并与未封闭组比较有无差异。4．3．统

8、计学分析：采用SPSSl