姜黄素联合伊立替康对大肠癌lovo细胞体外生长的影响与作用机制的初步-研究

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1、硕士学位论文目的：研究姜黄素、伊立替康及两者联合对体外培养大肠癌lovo细胞生长的影响，明确两者对大肠癌lovo细胞协同作用及其有效的联合给药方式，并探索两者协同作用机制。方法：一、MTT法检测不同浓度的姜黄素及伊立替康在不同时间对大肠癌lovo细胞增殖的影响：配制不同浓度的姜黄素及伊立替康溶液，其中姜黄素溶液按浓度为1．25、2．5、5、10、15、20、30、40ug／m配制，伊立替康溶液按浓度1．925、3．85、7．7、15．4、30．8、61．6、132．2ug／ml配制，体外培养的大肠癌lovo细胞消化后按5．103／孔

2、接种于96孔板中，设立实验组、阴性对照组及空白组，每组重复6个孔，在各个实验组分别加入预配制的姜黄素溶液和伊立替康溶液，避光条件下分别作用24、48、72、96、120h，在每个终止时间点用MTT法分别检测姜黄素、伊立替康对lovo细胞增殖的影响，分别计算两者对lovo细胞抑制率及绘制生长抑制曲线，筛选出姜黄素对lovo细胞增殖无抑制作用的最大浓度和伊立替康对lovo细胞在不同时间点的半抑制浓度(IC∞)；二、流式细胞术检测经不同方式联合姜黄素和伊立替康在不同作用时间对大肠癌lovo细胞的凋亡率：按3．105／ml的密度将tovo细

3、胞接种于60mm2的培养皿中，分别用两药混合法(按姜黄素：伊立替康=1：1的比例配制两药混合液，其中姜黄素实验浓度分别为5、10ug／ml，伊立替康实验浓度为56。201ug／ml，设立对照组及实验组，每组设立6个平行组)和贯序给药法(先用姜黄素作用24、48h，再用伊立替康作用24h，实验药物浓度及分组同上)联合姜黄素和伊立替康作用于lovo细胞，在每个终止时间点用流式细胞术检测每组lovo细胞的凋亡率；三、应用RT—PCR、免疫荧光、westernblot分别检测经不同浓度姜黄素在不同作用时问处理lovo细胞拓扑异构酶ImRNA

4、及蛋白水平的表达：按3．105／ml的密度将lovo细胞接种于60mm的培养皿中，设立对照组及实验组，每组设立3个平行组，姜黄素实验浓度分别为5、10ug／ml，作用时间分别为24、48h，在Ill中文摘要每个终止时间点应用RT-PCR、免疫荧光、westernblot分别检测lovo细胞拓扑异构酶ImRNA及蛋白水平的表达，对westem印迹胶片用Gel—ProAnalyzer软件进行光密度扫描定量分析，用目的蛋白和B—actin的积分光密度值(IOD)的比值来反映蛋白的相对表达水平。结果：一、不同浓度姜黄素在不同作用时间对lov

5、o细胞增殖的影响：不同浓度姜黄素作用于大肠癌Lovo细胞后，随着作用浓度增高，作用时间加长，lovo细胞增殖水平明显下降，姜黄素呈时间、剂量依赖型方式抑制大肠癌细胞增殖，其中，5ug／ml是姜黄素对lovo细胞的增殖无抑制作用的最大浓度，在不同的作用时间点，其在570nm波长下测得吸光度值与阴性对照组比较，两组间无统计学差异(P：扑=0．518、P4。h=O．433、P72h-=0．222、‰。=0．648、P唧h_0．117)(如图l所示)二、不同浓度伊立替康在不同作用时间对Iovo细胞增殖的影响：在不同时间段，不同浓度伊立替康对

6、lovo细胞的半抑制浓度分别为IC5024h=56．201ug／ml、IC50te“=21．183ug／ml、IC5072h=20．21lug／ml、IC50。。h=17．246pg／ml、IC50啪。=7．891ug／ml，其对lovo细胞增殖抑制方式亦呈时间、剂量依赖性(如图2所示)；三、不同给药方式联合姜黄素及伊立替康在不同作用时间诱导Iovo细胞凋亡率：(一)混合给药法：姜黄素+伊立替康联合组与伊立替康单药组对比，作用24h两组间对lovo细胞的早期凋亡率显著高于伊立替康单药组，两组间的差异有统计学意义(P=0．029)，但

7、晚期、总凋亡率两组间无统计学差异(P=0．314、0．229)：作用48h，两组间的早期、晚期及总凋亡率两药联合组均显著性高于伊立替康单药组，两组问差异有统计学意义(P=O．008、0．001、0．000)(如图3、4所示)；(二)贯序给药法：实验组与阴性对照组比较，经姜黄素处理组中伊立替康对lovo细胞的凋亡率明显增加，并随着姜黄素的浓度增加，作用时间延长，凋亡率也增加，两组间联合组显著性高于单药组，两组间差异有统计学意义(P<0．05)IV硕士学位论文(如图5、6所示)；(三)不同给药方式的比较：与混合给药处理组比较，贯序给药处

8、理组中经5ug／ml姜黄素作用24h中伊立替康对lovo细胞的早中晚期凋亡率均显著性高于24h两药联合组，两组间差异有统计学意义(P