外周th17treg失衡在动脉粥样硬化中的作用及全反式维甲酸对其的影响和机制论文

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1、安徽医科大学博士学位论文李庆2010衡在组织炎症和自身免疫性疾病的发生发展中具有重要作用。然而，在AS，尤其是ACS形成中的作用，尚未进行深入探讨。氧化低密度脂蛋白（Oxidizedlow-densitylipoprotein,ox-LDL）与动脉粥样硬化的发展密切相关，ox-LDL可通过多种途径损伤血管内皮，促进平滑肌细胞的增殖和泡沫细胞的形成，从而导致脂质条纹和粥样斑块的形成，并可影响斑块的稳定性和导致ACS的发生。然而，ox-LDL是否也通过破坏Th17/Treg平衡而促进AS和ACS形成，目前尚不清楚。全

2、反式维甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)是维生素A的主要衍生物。ATRA作为重要的生物活性物质，具有激素样作用，在体内产生广泛的生物效应。已有文献报道ATRA在Treg和Th17细胞分化中发挥重要作用。本研究首先检测ACS患者外周血Treg和Th17细胞数量、功能和相关细胞因子表达，探讨ACS患者外周Th17/Treg平衡的变化，然后通过细胞实验分析ATRA和ox-LDL对Th17/Treg平衡的影响，并从其对Treg和Th17细胞分化的影响来探讨其机理；同时从细胞凋亡的角度探讨ACS患

3、者Th17/Treg失衡的机制；最后复制早期大鼠AS模型，通过体内实验验证ATRA对Th17/Treg平衡的影响以及在AS发生中的作用，从而为今后预防和控制AS提供新的方法和依据，同时也为今后进一步开发治疗AS的药物提供新的思路。目的明确Th17/Treg平衡在AS中的作用和意义，并分析ATRA和ox-LDL对Th17/Treg平衡的影响和对在AS形成中的作用，探讨Th17/Treg失衡的机制和ATRA影响平衡的机理。方法（1）本实验首先以冠脉造影正常的对照组和AMI、UA、稳定性心绞痛（stableangina

4、,SA）患者为研究对象，采用多色免疫荧光素法标记细胞抗原，包括细胞膜表面和胞核抗原，如：CD4、CD25、CD127、FoxP3、IL-17等，多参数流式细胞术检测各组患者外周血Treg和Th17细胞表达水平；并应用FACS分选++low+-CD4CD25CD127、CD4CD25T细胞，进行混合淋巴细胞培养，比色法测定++lowCD4CD25CD127Treg细胞的抑制功能；RT-PCR检测Th17细胞转录因子RORγt和Treg细胞Foxp3表达水平；ELISA法检测人血清细胞因子水平IL-10、IL-17和

5、5安徽医科大学博士学位论文李庆2010ox-LDL表达情况；分析血清ox-LDL与Treg和Th17细胞水平的相关性，并通过细胞实验检测ox-LDL对Treg和Th17细胞数量和功能的影响。（2）通过细胞实验和凋亡检测进行机制探讨；ATRA和ox-LDL体外干预检测其对各组患者Th17/Treg失衡的作用，并通过细胞因子诱导实验从Treg和Th17细胞分化的角度分析ATRA影响Th17/Treg平衡的机制；通过流式细胞术检测Treg细胞凋亡和Fas/FasL表达，从细胞凋亡的角度分析ACS患者Treg减少和Th1

6、7/Treg失衡的可能机理。（3）采用高脂饮食和免疫损伤相结合，复制大鼠早期AS模型，检测各组Treg和Th17细胞表达情况，通过体内实验进一步验证ATRA对Th17/Treg平衡和AS发生的影响。结果（1）ACS患者外周Treg细胞表达率、相关细胞因子IL-10水平和Treg细胞转录因子FoxP3表达显著降低，Treg细胞抑制功能明显减弱；而外周Th17细胞表达率、相关细胞因子IL-17水平和Th17细胞转录因子RORγt表达显著增强。AMI和UA患者Treg/Th17比值显著低于SA患者和对照组(均P<0.0

7、1)。绝大部分对照组正常人++lowCD4CD25CD127/Th17比例大于5，SA组患者为2-4，UA患者1-1.5，AMI患者<0.7。AMI和UA患者血清ox-LDL浓度显著高于SA患者和NCA正常人（P<0.01）；此外，血清ox-LDL浓度与Treg细胞表达率呈显著负相关，而与Th17细胞表达率呈显著正相关(P<0.01)。细胞实验发现，随着ox-LDL浓度的增加和作用时间的延长，Treg细胞表达率降低，而Th17细胞表达率升高；ACS患者对ox-LDL诱导的Treg和Th17细胞变化更为敏感，变化程

8、度显著高于SA患者和对照组。（2）ATRA共同处理组Treg细胞表达水平明显高于ox-LDL处理组（均P<0.01），Treg细胞抑制功能也明显增强；而Th17细胞表达率显著低于ox-LDL处理组（均P<0.01）；正常人和SA患者PBMCs与ATRA作用48h后，其Treg和Th17细胞表达水平、Treg细胞抑制功能已与细胞对照接近，而UA和AMI患者也有显著恢复。正常