转运sirna的peg化egfr靶向免疫脂质体的制备及抗肝癌作用的研究

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1、第二军医大学硕士学位论文转运siRNA的PEG化EGFR靶向免疫脂质体的制备及抗肝癌作用的研究姓名：张莹莹申请学位级别：硕士专业：药剂学指导教师：陈建明201205转运siRNA的PEG化EGFR靶向免疫脂质体的制备及抗肝癌作用的研究摘要小干扰RNA(siRNA)能通过RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术在mRNA水平通过抑制靶基因的表达从而下调蛋白的表达。siRNA因其高特异性的基因沉默效率和低毒性等特点被认为是最具潜力的抗肿瘤药物。然而由于血液中存在的核酸酶及带正电荷的一些蛋白的存在使si

2、RNA在血液中不稳定，这就使得将siRNA传递到肿瘤细胞成为一个非常具有挑战性的任务。为了解决这个问题，许多siRNA传递系统发展起来。在这些系统中，主要包括：脂质依赖的系统、聚合物依赖的系统、肽结合系统、不同抗体单链片段融合蛋白系统。在这些不同载体系统中，阳离子脂质体因具有可自然降解、生物相容性好；可以将siRNA浓缩为带正电荷的磷脂复合物，免受核酸酶的降解等优点，使其成为自20世纪八十年代受到研究者的重视和应用最广泛的载体。为了进一步沉默靶基因，配体修饰的免疫脂质体成为当前的研究热点。目前，Huang等发明的茴

3、香酰胺靶向的LPD载体系统能将siRNA有效地传递到。受体过表达的肿瘤细胞。为了使LPD成为使用更广泛的载体系统，我们首次将抗体(anti．EGFR的Fab’)应用在LPD上，制得高PEG含量的TLPD．FCC。研究结果显示TLPD．FCC能有效的将siRNA传递到EGFR高表达的乳腺癌细胞，并具有良好的体内外基因沉默效率。然而，TLPD．FCC在EGFR高表达的肝癌细胞中并没有显示较好的基因沉默活性。因此，为了提高TLPD．FCC在肝癌细胞的基因沉默活性，本研究在我们之前的研究基础上对TLPD．FCC进行了一些改

4、造，包括降低PEG化程度和增加抗体连接效率等来优化处方，然后对该处方进行深入的体内外抗肿瘤活性的研究。首先，我们通过薄膜分散法制备DOTAP／Chol脂质体，然后将脂质体与鱼精蛋白、小牛胸腺DNA、siRNA混合制的裸的LPD，然后将PEG和抗体通过一定方式插入LPD中得到EGFR靶向的免疫脂质体。由于PEG化程度和抗体连接方式是影响脂质体靶向效率的两个主要因素，因此我们制备了不同PEG化程度(含PEG分别为5m01％、7．5m01％、10m01％)和不同抗体连接方式(传统方法和后插入方法)的免疫脂质体TLPD，然

5、后以粒径、zeta电位、抗体连接效率、siRNA基因沉默效率为指标进行处方优化，最后得到通过后插入方法制备的含7．5m01％PEG的免疫脂质体TLPD．FP75为最佳处方。然后我们考察了靶向与非靶向免疫脂质体(TLPD．FP75和NTLPD—FP75)对siRNA的结合能力、包封率、siRNA的血清稳定性、细胞内吞、转染效率和基因沉默效率。凝胶阻滞实验表明NTLPD．FP75和TLPD．FP75对siRNA均具有较强的结合第二军医大学硕士学位论文能力，这与高包封率(>85％)的结果一致。体外血清稳定性实验表明该载体

6、能明显的延长siRNA在血清中的时间至144h。通过共聚焦显微镜观察细胞内吞情况，发现转染TLPD．FP75的细胞中CFPE和Cy5．siRNA标记显著高于含NTLPD．FP75细胞，说明TLPD．FP75可以通过配体．受体介导的方式将siRNA内吞到细胞内。TLPD．FP75在不同EGFR表达的肝癌细胞(SMMC．7721／Hep3B／LM3)中转染效率和基因沉默效率的结果表明：TLPD．FP75的转染效率和基因沉默效率明显高于NTLPD．FP75，且具有一定的抗原特异性。在抗RhoA．siRNA实验中，TLPD

7、．FP75能有效的下调RhoA的表达并抑制细胞的迁移。在体内实验中，我们建立了SMMC．7721裸鼠的肝脏原位癌模型，探讨了转运siRNA脂质体的体内分布情况、细胞吸收及其基因沉默活性。体内组织分布结果表明，同NTLPD．FP75组相比，TLPD．FP75组能显著增加siRNA在肿瘤部位的聚集；另外体内细胞吸收结果显示，TLPD．FP75主要通过受体介导的内吞方式有效的聚集在肿瘤细胞。更为重要的是TLPD．FP75的体内基因沉默效率是要明显高于其它形式的脂质体。综上，本研究通过后插入方法制备的含7．5m01％PEG

8、的的免疫脂质体能特异性的将siRNA传递到EGFR过表达的肝癌细胞内，并具有良好的抗肿瘤活性。因此该载体可以作为潜在的基因治疗手段用于肝癌的临床治疗。关键词：靶向LPD，siRNA，PEG化，肝癌，EGFR，基因沉默，体内和体外转运siRNA的PEG化EGFR靶向免疫脂质体的制备及抗肝癌作用的研究ABSTRACTSmall(short)interfering