椒苯酮胺对全脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文椒苯酮胺对全脑缺血／再灌注损伤大鼠的保护作用ProtectiveEffectsofPiperphentonamineHydrochlorideonGlobalCerebralIschemia／reperfusionInjuryinRats课题来源：“国家重大新药创制”科技重大专项“十二五"计划(No：2011ZX09101—002．03)专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员药理学宾娟徐江平教授黎明涛教授刘培庆教授吕朝晖主任医师孙立主任医师袁牧教授臧林泉教

2、授刘叔文教授论文评阅人庞建新教授吕俊华教授2012年5月15日广州椒苯酮胺对全脑缺血／再灌注损伤大鼠的保护作用硕士研究生：宾娟指导教师：徐江平摘要目的：缺血性脑卒中(ischemicstroke)是由于血栓或动脉栓塞引起的脑血容量不足而出现的一过性脑病。脑缺血启动一系列生化分子机制，包括兴奋性氨基酸毒性、离子失衡以及自由基反应等等，最终造成脑功能失调。这一病理过程中，缺血时间和脑组织的耐受性显得至关重要，有研究报道大鼠遭受20至30min的全脑缺血就可以导致脑组织损伤。神经元细胞对低氧或低糖较为敏感，海马

3、CAl区神经元已被证实是缺血最易损伤的区域，10min的短暂缺血就可以造成71．6％的神经元坏死和空间学习记忆能力的缺失。脑缺血所导致的认知功能损害成为了脑卒中患者急需解决的一大难题。盐酸椒苯酮胺(Piperphentonaminehydrochloride，PPTA；化学名称：(E)．5．{(3，4．亚甲二氧基苯乙基)甲氨基}．1．对羟基苯基．1．戊烯．3．酮盐酸盐)为一用来治疗心力衰竭和缺血性心脏病的新型钙增敏剂类药物，其药效与已上市的心血管药物levosimendan相似。近期研究报道了levosi

4、mendan呈剂量依赖性地减轻创伤性脑损伤，进而提供神经保护作用。现有的药效学资料显示：PPTA具有不增加细胞内钙离子浓度、可通过增大血管平滑肌细胞钙敏感钾通道电流产生舒血管作用的特点。同时，PPTA在猫和大鼠的心肌缺血／再灌注损伤模型上具有良好的抗缺血作用。基于此，我们假设PPTA不仅能给缺血心肌提供保护作用，还能够减轻缺血对脑组织造成的损伤。因此，本实验建立大鼠全脑缺血／再灌注损伤模型，观察PPTA对大鼠海马区神经元损伤情况及学习记忆能力的影响：同时建立体外海马神经元和PCI2细胞氧糖剥夺损伤(oxy

5、gen—glucose中文摘要deprivation，OGD)模型，观察PPTA对细胞形态及细胞活力的影响。方法：(1)采用Pulsinelli四血管法(4一vessel．occlusion，4．VO)制作全脑缺血模型。健康雄性SD大鼠，造模成功后随机分为正常对照组、缺血再灌组(I／R)、PPTA剂量组(2．5、5、10mg／kg)。再灌注2h腹腔注射给药。Morris水迷宫和避暗实验测定大鼠学习记忆能力；病理切片Nissl染色观察海马神经元细胞丢失情况；试剂盒检测海马匀浆乳酸脱氢酶(Lactatedeh

6、ydrogenase，LDH)的含量；Real．timePCR检测海马诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、半胱天冬氨酸蛋白酶．3(caspase．3)、bcl．2以及bax基因表达情况。(2)体外培养海马神经元和PCI2细胞，分别采用物理和化学两种方法建立细胞氧糖剥夺损伤模型，观察细胞形态学变化；四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyltetrazolium，MTT)法检测不同浓度PPTA对细胞活力的影响；测定细胞外液LDH和NO的浓度；Real．timePCR检测细胞iNOS、caspase．3、bc

7、l一2及bax基因表达情况；Westernblot测定iNOS蛋白水平。结果：1、大鼠全脑缺血／再灌注损伤实验(1)Morris水迷宫定向航行试验中，随着学习时间的延长，各组大鼠的逃避潜伏期均有所减少，从d3开始出现统计学差异，表现为模型组大鼠较假手术组显著延长，PPTA5和10mg／kg组较模型组显著减少。这说明全脑缺血损伤造成大鼠空间学习记忆能力显著下降，而给予PPTA药物治疗后能够改善大鼠记忆缺失的情况。空间探索试验中，假手术组探索时间显著长于模型组，除PPTA2．5mg／kg组无显著性差异外，PP

8、TA5和10mg／kg组与模型组比较均有统计学意义。整个实验过程中各组大鼠的游泳速度没有出现显著性差异，这表明大鼠学习记忆能力的缺失与自身原因无关，同时PPTA能增强术后大鼠的空间学习记忆能力。避暗实验中，由于大鼠的趋暗习性，表现为训练时期各组大鼠进入暗箱的时间没有显著性差异，假手术组遭受电击24h后潜伏期显著延长，显示大鼠对电击损伤形成记忆；而模型组大鼠较假手术组显著缩短，PPTA5和10mg／kg组能有效地缓解缺血大鼠的长