栉孔扇贝(chlamys farreri)酚氧化酶的分离纯化及特性研究

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1、中国海洋大学博士学位论文栉孔扇贝（Chlamysfarreri）酚氧化酶的分离纯化及特性研究姓名：蒋经伟申请学位级别：博士专业：水产养殖指导教师：战文斌；邢婧201206栉孔扇贝(Chlamys力脚“)酚氧化酶的分离纯化及特性研究栉孔扇贝(Chlamysfarreri)酚氧化酶的分离纯化及特性研究摘要前期研究发现，细菌多糖刺激和病毒感染均可导致栉孔扇贝(Chlamysfarreri)血细胞中酚氧化酶活力急剧升高，表明酚氧化酶是栉孔扇贝免疫应答系统中最为敏感高效的因子之一(Xingeta1．，2008；Lineta1．，2011)。本论文从栉i孔扇贝血细胞中分离纯化出酚氧化

2、酶，分析了该酶的生化及酶学特性；研究了酚氧化酶体外氧化产物的抗菌活性；分析比较了栉孔扇贝酚氧化酶与海湾扇贝(Argopectenirradians)、菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)、毛蚶(Scapharcasubcrenata)酚氧化酶在生化及酶学特性上的差异，为栉孔扇贝酚氧化酶免疫机制的研究积累了数据。(1)栉孔扇贝酚氧化酶的分离纯化及生化和酶学特性研究。采用线性连续梯度非变性电泳(native．PAGE)结合凝胶过滤层析的方法从栉孔扇贝血细胞中分离纯化出酚氧化酶，研究了该酶的底物特异性、

3、动力学参数以及温度、pH、二价金属离子和抑制剂对酶活的影响。结果显示：提纯的酚氧化酶在native．PAGE中分子量为576kDa，SDS—PAGE中分子量为53kDa，表明该酶是由一种亚基组成的寡聚体；酚氧化酶对L．DOPA、邻苯二酚、多巴胺和对苯二酚的米氏常数‰分别为O．61mmol／L、0．20mmol／L、0．88mmol／L和O．83mmol／L，表明该酶是一种漆酶型的酚氧化酶，其对邻苯二酚的亲和力最高，对多巴胺的亲和力最低，对L．DOPA的亲和力高于对苯二酚；酚氧化酶在30"C和pH8．0时具有最高酶活力；酚氧化酶活力受到Ca2+和M矿+的强烈激活，但受到Fe

4、2+的显著抑制；酚氧化酶活力不受硫代尿素和叠氮钠的影响，但受到抗坏血酸、亚硫酸钠、柠檬酸、半胱氨酸、二乙基二硫代氨基甲酸钠(DETC)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的强烈抑制，表明该酶是一种含铜的金属酶。(2)栉子L扇贝酚氧化酶体外氧化产物的抗菌活性研究。通过观察和测定提纯的栉孔扇贝酚氧化酶与底物处理后的细菌生长情况，研究了栉孔扇贝酚氧化酶体外氧化产物对溶藻胶弧菌Vibrioalginolyticus、副溶血弧菌Fibrioparahaemolyticus、杀鲑气单胞菌Aeromonassalmonicida、爱德华氏茵Edwardsiellatarda、停乳链球菌Str

5、eptococcusdysgadysgalactiae、海豚链球菌Streptococcusiniae和溶壁微球菌Micrococcuslysodeikticus的抗菌活性。细菌生长曲线测定结果显T栉孔扇贝(Chlamysfarreri)酚氧化酶的分离纯化及特性研究示：酚氧化酶自身不能抑制细菌生长，酚氧化酶与L．DOPA或多巴胺的混合物可抑制细菌生长，表明是酚氧化酶的氧化产物而不是酚氧化酶具有抗菌活性；使用L-DOPA作底物时，酚氧化酶氧化产物仅对杀鲑气单胞菌显示出明显的抑制作用，而使用多巴胺作为底物时，酚氧化酶氧化产物对革兰氏阴性的溶藻胶弧菌、副溶血弧菌和杀鲑气单胞菌均

6、表现出强烈的抑制作用，表明以多巴胺为底物获得的酚氧化酶氧化产物比以L．DOPA为底物获得的氧化产物具有更强的细胞毒性；酚氧化酶的体外氧化产物对革兰氏阳性的停乳链球菌、海豚链球菌和溶壁微球菌无抑制作用，表明与链球菌和微球菌相比，栉孔扇贝酚氧化酶氧化产物对弧菌和气单胞菌细胞成分的毒性作用更大；酚氧化酶氧化产物对同为革兰氏阴性的爱德华氏菌无抑制作用，分析原因可能是爱德华氏菌分泌的胞外产物中含有一些具有抗氧化活力的多糖，这些多糖抑制了酚氧化酶的氧化反应。显微镜检测结果显示：经过与栉孔扇贝酚氧化酶和多巴胺的共孵育后，溶藻胶弧菌、副溶血弧菌和杀鲑气单胞菌的菌体透明度降低，多数菌体丧失

7、了运动能力，细菌聚集成团，被黑色素所覆盖。(3)栉孑L扇贝酚氧化酶与海湾扇贝、菲律宾蛤仔、皱纹盘鲍、毛蚶酚氧化酶的生化及酶学特性比较研究。采用线性连续梯度非变性电泳结合邻苯二酚发色方法从海湾扇贝、菲律宾蛤仔、皱纹盘鲍、毛蚶的血细胞中分离出酚氧化酶，分析比较了栉孔扇贝酚氧化酶与海湾扇贝、菲律宾蛤仔、皱纹盘鲍、毛蚶酚氧化酶在底物特异性、动力学参数以及金属离子和抑制剂对酶活的影响上的差异。结果显示：在检测到的酚氧化酶种类上，栉孔扇贝与海湾扇贝、菲律宾蛤仔、皱纹盘鲍相同，在血细胞中仅检测到一种酚氧化酶，而从毛蚶的血细胞中则检测出4种酚