丁苯酞对sod1-g93a转基因鼠脊髓前角运动神经元nrf2及h0-1表达的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文丁苯酞对SOD1--G93A转基因鼠脊髓前角运动神经元Nrf2及H0-1表达的影响姓名：闫欣申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：刘亚玲201203中文摘要丁苯酞对SODl-G93A转基因鼠脊髓前角运动神经元Nrf2及HO-1表达的影响摘要目的：肌萎缩侧索硬化(AmyotrophicLateralSclerosis，ALS)是一种慢性进行性神经系统变性疾病，选择性累及上、下运动神经元，表现为进行性加重的肌肉无力和萎缩，最终因呼吸肌麻痹死亡，目前尚无有效治疗方法。该病约5％．10％有家族史，为家族性肌萎

2、缩侧索硬化(FamilialAmyotrophicLateralSclerosis，FALS)，另外约90％为散发性肌萎缩侧索硬化(SporadicAmyotrophicLateralSclerosis，SALS)，两者临床表现和病理表现相似。研究发现20％FALS的发病与编码Cu／Zn超氧化物歧化酶(Cu／ZnSODl)的基因突变有关，SALS的发病与谷氨酸兴奋毒性、自身免疫机制、氧化应激、神经丝异常、线粒体功能异常等有关，各种因素相互影响，且均与氧化应激相关，因此氧化应激有是目前肌萎缩侧索硬化治疗研究的重点。研究发现ALS的

3、发病机制与氧化应激有关，氧化应激与ALS的关系也是近年来研究的热点。机体抗氧化防御系统包括酶系和非酶系抗氧化防御系统。ARE(抗氧化反应元件，antioxidantresponseelement)是多种抗氧化酶／解毒酶基因5’侧翼所共有的一段增强子序列，这段序列是诱导激活所必须。而抗氧化剂发挥神经元保护作用的关键分子即是Nrf2蛋白。在多种组织中Nrf2／ARE信号通路的激活都可诱导一系列内源性的细胞保护基因的上调，其中包括抗抗氧化酶、氧化蛋白、解毒和抗炎的蛋白。在神经组织中这些抗氧化酶和抗氧化蛋白的表达增多，可对抗由谷氨酸、过

4、氧化氢及多巴胺等引起的氧化损伤。HO．1就是其中一种重要的抗氧化蛋白，它能分解血红素，生成一氧化氮、自由铁和胆绿素。胆绿素及其代谢生成的胆红素是一种生理性的自由基清除剂，可以抵抗氧化应激保护神经元。因此Nrf2／ARE信号通路的激活有望成为神经变性疾病治疗的新靶点。丁基苯酞(d1．3．n。butylphthalide，NBP)是我国近年来开发的一个新型抗脑缺血药物。它是芹菜种子的提取物。在2002年，首次被中国国家食品药品监督管理局批准应用于中风患者。实验证明，它的神经保护作用机中文摘要制是多方面的，包括减少氧化应激损伤、增加缺

5、血区脑血流量、抑制炎症反应、重构缺血区微循环、改善线粒体的功能和抗细胞凋亡等。因此，丁苯酞可能对SODl．G93A转基因小鼠发病过程有一定影响。本研究通过免疫组化、蛋白印迹技术观察丁苯酞对肌萎缩侧索硬化SODl．G93A鼠发病过程中脊髓前角运动神经元Nrf2及HO．1表达的影响，进一步了解丁苯酞神经保护作用机制，为ALS治疗研究及开发丁苯酞用途提供依据。方法：l动物模型的建立转人类SODl．G93A小鼠和同窝非转基因小鼠是由美国JacksonLab引进的B6SJL．BTg(SODl．G93A)1Gur／J半合子雄鼠与B6SJLF

6、l／J+／+雌鼠1：l杂交繁殖而来，通过剪取小鼠尾尖提取DNA，用聚合酶连反应(PCR)鉴定小鼠是否携带突变的SODl．G93A基因。2动物分组及处理筛选鉴定出SODl．G93A阳性的小鼠48只，并随机将其分为低、中、高剂量丁苯酞组和安慰剂组，选同窝hSODl．G93A阴性小鼠作为阴性对照组，每组各12只，雌雄各半。通过灌胃的方法每天给转基因小鼠服用丁苯酞和玉米油。于小鼠6周龄起分别按照60mg／kg、120mg／kg、180mg／kg的剂量对三个治疗组小鼠进行灌胃，安慰剂组给予同等量(10ml／kg)的玉米油灌胃，一天一次。3

7、发病时间及生存期观察参考Vercelli等的1．5分评分法进行评分，4分为发病时间，1分为死亡时间。5分：无运动功能障碍4分：将小鼠悬吊时出现后肢伸展异常或震颤3分：明显的后肢无力、步态异常2分：双后肢完全瘫痪，爬行仅靠前肢1分：双后肢完全瘫痪，并且将小鼠仰卧后20s内小鼠不能翻转4免疫组化用10％水合氯醛将小鼠麻醉后，心脏灌注4％多聚甲醛固定20min，快速取出小鼠脊髓腰段以4％多聚甲醛固定48h，振动切片30um厚，免中文摘要疫组织化学法观察髓前角神经元Nrf2、HO一1表达分布。5免疫印迹10％水合氯醛腹腔注射将小鼠麻醉后

8、，新鲜取小鼠脊髓腰段，液氮速冻，．80℃储藏，提取总蛋白用蛋白免疫印迹的方法检测各组小鼠腰髓Nm、HO．1蛋白表达。6统计学方法采用SPSS13．0统计学软件对数据进行统计处理。各组数据均用x±SEM表示。Kaplane．Meier(K．M)生存曲线用于发病时间