一粒小麦籽粒硬度基因pinam,pinbm,gspm相关载体的构建及遗传转化

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1、山东农业大学硕士学位论文一粒小麦籽粒硬度基因Pinam，Pinbm，Gspm相关载体的构建及遗传转化姓名：于海燕申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：孔令让20120614山东农业人学硕。{：学位论文中文摘要籽粒硬度对谷物的加工品质具有重要影响，在众多的小麦族植物(尤其是小麦)中，籽粒的硬度性状主要由5D短臂上的Hardness(Ha)位点的两个主效基因，即Puroindolinea(Pina．D1)和Puroindolineb(Pinb．DI)控制，同时受基因GrainSoftnessProtein．J『

2、(Gsp．J)的影响。这三个基因所表达的蛋白(friabilin)分散在小麦胚乳内，它与淀粉粒表面的脂质相互作用影响着籽粒的硬度。本研究以一粒小麦(Zmonococcum)DV92作为尸砌矿、Pinbm和Gspm基因的供体，构建了相关的表达载体5个；诱导普通小麦品种“科农199”成熟胚愈伤16909个和幼胚愈伤l1081个用于基因枪介导的遗传转化；经Biolaphos(化学除草剂)筛选获得抗性植株；再经PCR检测获得阳性植株。主要研究结果如下：(1)相关表达载体的构建：以一粒小麦DV92基因组DNA为模板，用pGE

3、M构建完成了单基因表达载体pGEM-pinam、pGEM-pinbm、pGEM-gspm；两基因串联表达载体pGEM-pinam-pinbm；以及三基因串联表达载体pGEM-Pinam-Pinbm．Gspm。(2)遗传转化：通过组织培养获得“科农199”成熟胚愈伤16909个，其中13199个愈伤用于基因枪轰击转化两基因串联表达载体pGEM-pinam．pinbm；幼胚愈伤10130个，其中4522个愈伤基因枪轰击转化两基因串联表达载体pGEM．pinam—pinbm，5608个愈伤基因枪轰击转化三基因串联表达载体

4、pGEM．Pinam．Pinbm-Gspm。(3)抗性筛选：基因枪轰击的5608个小麦幼胚愈伤，经Biolaphos(化学除草剂)抗性筛选，最终获得933株再生植株(本研究只对后期所培养的部分幼胚分化所得抗性苗进行了检测)。(4)PCR检测：再生植株中鉴定出ll株阳性植株，有关转基因植株的籽粒硬度还需进一步实验验证。本研究将Pinam、Pinbm和Gspm三个软粒基因串联连接到表达载体上，并将其转化到硬质普通小麦品种“科农199”中，实现了三基因共同转化普通小麦，克服多个单基因逐个转化时选择标记替换使用问题，减少组

5、织培养、遗传转化和DNA提取的工作量。实现了软粒基因在普通小麦中的遗传转化，为利用基因枪介导的遗传转化方法改良小麦提供了可行性。关键词：小麦；籽粒硬度基因；遗传转化；一粒小麦籽粒硬度基因Pina”，Jpfn矿，6E矿相关载体的构建及遗传转化ConstructionandGeneticTransformationofPina臃，Pinb朋，Gsp肌relatedvectorswhichcontrollingtheGrainTextureofZmonococcHmAbstractGraintexturehasanimp

6、ortantinfluenceonprocessingquality,andiscontrolledbythesiteofHaconsistofPuroindolinea(P加咖D1)andPuroindolineb(Pinb．DI)whicharelocatedonshortarmofdismal5Dchromosome，andalsoisimpressedbytheGrainSoftnessProtein一』(Gsp—J『)．Friabilinisakindofaminoacidwhichistheproduc

7、tofthesegenesspreadintoendosperm，anditinteractswithlipidsatthesurfaceofstarch．Inthisstudy,thecultivarDV92(7=monococcum)isemployedasadonorofgenesofPinam、PinbmandGspm，andfiverelatedexpressionvectorsarecompleted．Totallly,16909maturecalliand13199immanwecalliofcomm

8、onwheatcultivar‘‘Kenong199’’arerespectivelyusedforgenetictransformationwhichismediatedbythegenegun．RegeneratedplantsareobtainedafterBiolaphosscreening，andthepositiveplantsareidertf