羊肺炎支原体内蒙古分离株的同源性研究及双重pcr检测方法的建立

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1、分类号S852学校代码10129UDC11.220学号2009201107羊肺炎支原体内蒙古分离株的同源性研究及双重PCR检测方法的建立StudiesonHomologyofMycoplasmaovipneumoniaefromInnerMongoliaIsolatedStrainsandConstructionofDuplexPCRDetermineAssay申请人：张明月学科门类：农学学科专业：临床兽医学研究方向：反刍动物抗病性研究指导教师：吴树清教授论文提交日期：二〇一二年五月摘要羊传染性胸

2、膜肺炎，是由多种致病支原体引起山羊和绵羊的一种高度接触性的传染病，该病已成为严重危害我区养羊业健康发展的主要传染病之一。本实验从内蒙古自治区不同地区疑似支原体肺炎发病羊及病死羊样本中分离培养支原体，经形态观察、生化试验和分子生物学方法确定由绵羊和山羊体内分离到的两株支原体均为绵羊肺炎支原体，证实绵羊肺炎支原体既能感染绵羊也可感染山羊。通过提取支原体DNA，扩增、克隆、测定16SrRNA部分序列，与绵羊肺炎支原体国际标准株Y-98进行比对，分析发现两株菌与模式株的同源性均在99.8%以上。而通过RA

3、PD技术比对了分离株与模式株在基因组上的差异，发现以同一种方法制备DNA模板在同一引物、相同条件下，分离株与模式株扩增出的条带大小有明显差异，说明地方分离株可能存在一定变异。为今后选取地方代表株进行疫苗和药物研制奠定了基础。实验还根据丝状支原体山羊亚种(Mycoplasmamycoidesubsp.capri,Mmc)和绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae,MO)两类病原的16SrRNA保守核酸序列设计了两对特异性引物，建立的双重PCR检测方法可以对这两类病原同时做出准确

4、鉴别诊断，并用此法对临床样本进行检测。结果显示：该方法具有良好的特异性，MO模式株Y-98和MMC标准株PG3分别扩增出与预期结果相符的200bp和400bp片段，2株实验室分离支原体与Y-98扩增结果一致，诊断为绵羊肺炎支原体，与生化和血清学鉴定结果相符；该方法检测精氨酸支原体（Mycoplasmaarginini）、解脲支原体（Mycoplasmaurealytium;Uu）、猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae）、羊链球菌（Caprinechaincoccus）、葡萄

5、球菌（Staphylococci）、多杀巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）、大肠杆菌O78（Escherichiacoli）等参考菌株均呈扩增阴性，说明该检测体系设计的引物特异性高。该方法能分别检测出5pg/μL的MMCDNA和0.5pg/μL的MODNA，或同时检测出5pgMMC/μL和1pg/μLMO混合的DNA，说明具有很好的敏感性。关键词：绵羊肺炎支原体；羊传染性胸膜肺炎；同源性分析；双重PCR检测StudiesonHomologyofMycoplasmaovipneum

6、oniaefromInnerMongoliaIsolatedStrainsandConstructionofDuplexPCRDetermineAssayAbstractMycoplasmapneumoniaeofSheepandGoatisakindofinfectiousdiseasewithhighlyinfectiositycausedbyseveralmycoplasmas,ithasbecomeoneofthemostharmfulcommunicabletothehealthydev

7、elopmentofourregion'ssheepindustry.Inthisstudy,SuspectedMycoplasmapneumoniaofsheepandgoatwasisolatedbyclinicalcasessamplescollectedfromthedifferentregionsofInnerMongoliaAutonomousRegion.Aftertheexperimentsofisolationandculture,morphologyobserving,bioc

8、hemicaltestsandmolecularbiologicalmethodstodeterminethatthetwoisolatesoftheMycoplasmaareMycoplasmaovipneumoniae,confirmingMycoplasmaovipneumoniaecaninfectbothsheepandgoats.WealsoextractDNAofmycoplasma,thenamplificat,cloningobjectivefragmentand