酮色林抗内毒素休克的inos机制研究

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1、第二军医大学硕士学位论文酮色林抗内毒素休克的iNOS机制研究姓名：张鑫申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：蔡国君；刘冲201205摘要研究目的：感染性休克是由微生物及其代谢产物在机体内引起微循环障碍，导致细胞与器官代谢和功能损害的全身反应性综合征。当机体遭受微生物毒素侵入时，机体会分泌大量的炎症介质，如肿瘤坏死因子．Ⅸ(TNF．Oc)、白介素．1(IL．1)、白介素一6(IL．6)以及一氧化氮(Nitricoxide，NO)等，导致机体血液循环遭到破坏，产生低血压，激活凝血途径等，最后致使器官损害甚至衰竭

2、。目前，针对感染性休克的治疗方法有很多，包括积极治疗原发病，补充血容量，给予血管活性物质以及抗生素，拮抗细胞因子防治细胞损伤，甚至血液透析以保护重要器官功能防治衰竭等。尽管其病理过程以及其治疗措施已经取得了很大的进展，但是未能有效的应用于临床，如细胞因子拮抗剂或单克隆抗体在动物实验都能取得一定的效果，但其临床试验结果却令人失望；以及其高昂的治疗费用，愈后病人的生活质量等问题的存在，致使感染性休克成为非心血管重症监护病房的主要死因，死亡率高达40％一75％，并且每年都不断上升。因此，寻找新的行之有效的治疗方法以

3、及其具体的作用机制就变得非常重要。酮色林(Ketanserin)，作为一种5一羟色胺2A(5-hydroxytryptamine2A，5-HT2A)受体拮抗剂，大剂量时，对仅1受体有阻断作用。因其具有良好的降压作用，在临床上一直被用来治疗高血压。近几年，研究者发现了5-HT2A在炎症反应和免疫反应中的作用，已在动物模型上研究了其拮抗剂对糖尿病肾病、关节炎等治疗作用。本课题组在教研室前期的研究基础上，已经证实了酮色林对内毒素休克有着良好的治疗作用，但是其具体的分子机制还未见报道。一氧化氮具有许多生物活性，一度成

4、为研究者关注的焦点，许多研究已经证实了NO在感染性休克中的病理意义，是导致感染性休克病人低血压的关键分子。体内NO合成的基本底物是L一精氨酸(L—arginine)与02，在一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)的催化作用下生成NO与L．瓜氨酸(L．citrulline)。NOS又三种同工酶：主要存在于内皮细胞的eNOS(endothelialnitricoxidesynthase)，存在于神经细胞的nNOS(neuronalnitricoxidesynthase)，以及存在于巨噬细胞

5、、角质细胞中等的可诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)。eNOS和nNOS统称为eNOS(constitutivenitricoxidesynthase)。在感染性休克中，研究发现细菌毒素可诱导iNOS表达，进而产生千倍于生理基础的NO。这些过量的NO可激活平滑肌细胞内的可溶性鸟苷酸(sGC)，持续产生大量的cGMP，舒张血管平滑肌，增加细胞通透性，降低血管对收缩因子的反应性，使血压更加降低，也可抑制心肌收缩力，加重休克。所以，降低NO含量应可成为治疗感染性

6、休克的一种有效的方法。关于感染性休克病理过程的研究非常多也很深入，其中涉及其中的有核因子kappaB(nuclearfactorkappaB，NF．1(B)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen·activatedproteinkinases，MAPKs)等。因此，我们将酮色林内毒素休克的分子机制作为研究重点，提出假设：酮色林通过抑制iNOS表达，达到治疗内毒素休克的目的，其中涉及的信号转导分子有NF．KB和MAPKs。研究方法：本研究首先以内毒素诱导的休克小鼠为模型，利用整体动物实验方法研究酮色林对内毒素诱导

7、的iNOS蛋白表达的作用，使用Westernblotting和免疫组织化学的方法对iNOS表达进行检测；以及用Griessreagent法检测体内NO水平的变化。其次，利用小鼠巨噬细胞系(RAW264．7细胞)，检测酮色林对内毒素刺激诱导其iNOS蛋白质和mRNA水平的影响，分别使用Westemblotting法和RT．PCR法；并用ELISA法检测酮色林对其炎症因子(n盯．a、IL．6)水平的影响。最后，我们在RAW264．7细胞上研究酮色林抑制内毒素诱导iNOS表达的具体分子机制，观察5-HT2A、NF．

8、1(B以及MAPKs在整个过程发挥的作用，分别使用工具药研究方法和分子生物学检测方法。结果：1．以内毒素诱导的休克小鼠为模型，分别给予不同剂量(3meCkg、10mg／kg)酮色林，检测其对iNOS表达以及NO水平的影响。结果显示酮色林在不同剂量时，可不同程度iNOS表达的抑制，降低NO水平，其中10mg&g剂量组作用更为明显。2．在RAW264．7细胞上，给予内毒素(100ng／m1)刺激，共同孵