糖皮质激素增强人卵巢癌细胞对化疗药物抵抗及其机制的研究

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1、第二军医大学博士学位论文糖皮质激素增强人卵巢癌细胞对化疗药物抵抗及其机制的研究姓名：方芳申请学位级别：博士专业：妇产科学指导教师：惠宁201205糖皮质激素增强人卵巢癌细胞对化疗药抵抗及其机制的研究中文摘要卵巢癌是妇科肿瘤死亡率最高的肿瘤，因其早期症状不明显，待到肿瘤发现时大部分已经是晚期，而且卵巢癌易于转移，即便是能早期发现行手术治疗，治疗后也需辅以化疗，因此大部分的卵巢癌患者都需要接受化疗。人工合成的糖皮质激素(GC)如地塞米松(Dex)因其能够减轻化疗所导致的恶心、呕吐以及组织水肿等毒副作用而作为化疗方案中的辅助用药常规应用于卵巢癌的治疗中。然而，近年来陆续

2、有报道表明，GC能够抑制多种肿瘤细胞的凋亡作用，如GC在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌和卵巢癌等细胞系中，能明显抑制由化疗药物诱导的细胞凋亡，这些化疗药物包括顺铂、紫杉醇、5-Fu、阿霉素和放线菌素D。在其他一些上皮来源的肿瘤如神经胶质瘤以及神经纤维肉瘤等细胞中这种现象也被证实。ZhangC等在体内和体外实验中均证实GC处理胰腺癌细胞将诱导化疗耐药。但是关于糖皮质激素抵抗化疗的具体机制目前尚不很清楚。本实验旨在卵巢癌细胞系HO一8910和SKOV3中探讨Dex是否抵抗化疗药物顺铂和紫杉醇对卵巢癌的凋亡作用以及其-叫-ZH3,匕l--,的机制。本课题首先检测了顺铂、

3、紫杉醇两种化疗药单独及联合Dex对卵巢癌HO．8910和SKOV3细胞存活的影响。结果表明，顺铂和紫杉醇单独作用能显著的以浓度依赖性的方式降低细胞的存活，但两者合用存活的细胞数却较单独顺铂组明显增加。本校病理生理学教研室之前的研究发现，用Dex处理HO一8910细胞和用无水乙醇处理细胞相比，胰酶消化细胞所需时间显著延长。分别用100nMDex和无水乙醇处理HO．8910细胞24d',时后，用0．25％胰酶消化，所需的消化时间各自为164-3．5min、44-0．5min。在另一株卵巢癌细胞系第二军医大学博士学位论文SKOV3中也发现同样的现象。说明Dex可能增强了

4、细胞与细胞外基质之间的粘附能力。为此我们进一步研究了Dex对细胞粘附能力的影响。细胞外基质(ECM)是由细胞合成并分泌到胞外，分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要分四大类，分别是胶原；非胶原糖蛋白，如纤维粘连蛋I兰l(fibronectin，FN)、层粘连蛋白(1aminin，LN)、玻璃粘连蛋I刍(vitronectin，VN)等；弹性蛋白；蛋白聚糖及氨基聚糖，如透明质酸(hyaluronicacid，HA)。由于Dex能够增加卵巢癌细胞与基质的粘附能力，而己知细胞与基质的粘附主要取决于细胞外的基质成分和细胞表面的粘附分子。因此我们首先观察了Dex对HO．89

5、10细胞ECM成分表达与分泌的影响。细胞与ECM间的粘附是一个多因素参与的过程。其粘附能力的大小除了受ECM成分的影响外，还取决于细胞膜上的粘附分子的表达情况。介导细胞与ECM之间粘附的粘附分子主要是整合素家族和CD44家族。病理生理教研室前期的研究发现Dex能上调人卵巢癌HO一8910中整合素Q4B1和Q5131的表达水平。为明确整合素B1亚基在Dex介导的促进细胞粘附和保护细胞对抗化疗药物促凋亡的作用。我们用整合素B1的中和抗体来处理细胞，观察Dex对细胞粘附能力的调节作用是否受到影响。CD44也是参与介导细胞与细胞外基质之间的粘附作用的重要粘附分子。因此我们

6、进一步用CD44的中和抗体来阻断CD44的信号通路，观察Dex是否通过CD44增加HO一8910细胞与细胞外基质的粘附。结果表明Dex是通过细胞表面粘附分子的受体增强HO一8910与细胞外基质的粘附能力。整合素与细胞外基质结合后，能通过激活FAK，进一步激活下游的多条信号转导通路。PI一3K—AKT通路是FAK下游的信号转导通路之一。既往的研究表明PI。3K—AKT活化后能保护多种细胞，如上皮细胞、成纤维细胞等免于因紫外线照射、去除培养液中的血清或生长因子以及使贴糖皮质激素增强人卵巢癌细胞对化疗药抵抗及其机制的研究壁培养的上皮细胞被悬浮等所诱导的细胞凋亡。因此我们

7、首先观察了Dex对FAK活性的影响。我们进一步检测了PI一3K下游的AKT的磷酸化水平。并使用AKT的抑制剂wortmanin观察其是否能阻断Dex促进细胞存活和抗化疗药诱导的凋亡作用。以上结果表明PI．3K／AKT通路介导了Dex对紫杉醇诱导的细胞凋亡的保护作用。本校病理生理教研室之前的研究发现，Dex能明显增强卵巢癌HO．8910细胞和SKOV3细胞与瓶壁的粘附能力。这种作用与Dex上调整合素家族粘附分子的表达有关。但是Dex是否影响卵巢癌细胞ECM成分的表达和分泌还不清楚。Dex增加细胞粘附后，通过激活哪些下游信号转导通路介导Dex抵抗化疗药诱导凋亡的作用也

8、不清楚。本