止消通脉宁干预转化生长因子―β1诱导人肾小管上皮细胞表型转化探究

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1、止消通脉宁干预转化生长因子一B1诱导人肾小管上皮细胞表型转化探究摘要：目的观察止消通脉宁药物血清对转化生长因子-Bl(TGF-B1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)表型转化的影响，并探讨其机制。方法将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基培养并分为空白对照组、TGF-B1诱导组(TGF-B110ng/mL).空白血清对照组(TGF-B110ng/mL+10%空白血清)、干预1组(TGF-B110ng/mL+10%低剂量止消通脉宁药物血清)、干预2组(TGF-B110ng/mL+10%中剂量止消通脉宁药物血清)、干预3组(TGF-B110ng/mL+10%高剂

2、量止消通脉宁药物血清)。药物干预24h后，免疫组化检测a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。在24、48、72h应用酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中I型胶原(ColI)、III型胶原(ColIII)和纤连蛋白(FN)的含量。结果正常IIK-2细胞表达E-cadherin,不表达a-SMA,经TGF-B1刺激后细胞表型发生转变，E-cadherin的表达明显减弱，a-SMA表达明显增强，且Coll、ColIII和FN的分泌明显增加，与空白对照组比较差异有统计学意义(P传代培养的HK-2细胞分为6组。空白对照组：DMEM/F12培养液；TGF-B1

3、诱导组：DMEM/F12培养液+10ng/mLTGF-Bl；空白血清对照组：DMEM/F12培养液+10ng/mLTGF-B1+10%空白血清；干预1组：DMEM/F12培养液+10ng/mLTGF-B1+10%低剂量止消通脉宁药物血清；干预2组：DMEM/F12培养液+10ng/mLTGF-31+10%中剂量止消通脉宁药物血清；干预3组：DMEM/F12培养液+10ng/mLTGF-31+10%高剂量止消通脉宁药物血清。2.3指标检测2.3.1细胞免疫化学法检测人肾小管上皮细胞、a-平滑肌肌动蛋白、E-钙黏蛋白的表达2.3.1.1盖玻片包被18mmX18mm盖玻片切割成1/4大小，

4、自来水浸2h,风干后浓硫酸浸泡过夜，自来水清洗干净，95%乙醇浸泡12h,高压灭菌。使用前将灭菌后的玻片置于24孔板，滴加0.1mg/mL无菌多聚左旋赖氨酸浸没盖玻片，包被5min,使多聚赖氨酸充分黏附在盖玻片上，吸干多聚赖氨酸，无菌水彻底冲洗，超净台风干，紫外线照射20min灭菌备用。2.3.1.2细胞爬片制备于24孔板中包被盖玻片后，细胞以2X104个/mL密度接种，每孔1mL,孵育24h,吸弃细胞上清，加入无血清培养液1mL静止24h,使其同步化。弃细胞上清，按分组加入含相应浓度药品的培养液，每孔1mL,继续培养24ho取出细胞爬片，用0.01mol/LPBS漂洗5minX3次

5、。4%多聚甲醛固定20min,-20°C保存备用。2.3.1.3细胞免疫化学法染色3%H202去离子水（无色液体）室温孵育10min,以消除内源性过氧化物酶活性，蒸馆水冲洗后PBS浸泡5min,微波抗原修复，正常山羊血清室温孵育10〜15min封闭非特异结合位点，滴加适当比例稀释的小鼠抗人a-SMA多克隆抗体，或兔抗人E-cadherin多克隆抗体，4£过夜。第2日取出并恢复至室温，PBS冲洗3minX3次，相继与二抗及ABC试剂各孵育15min,最后DAB显色和苏木素复染，乙醇梯度脱水后中性树胶封片（细胞爬片倒扣于载玻片上）。显微镜观察细胞形态，并拍照，棕黄色部位为抗原阳性表达部位

6、。2.3.2酶联免疫吸附法检测人肾小管上皮细胞I型胶原、III型胶原和纤连蛋白的分泌细胞以2X104个/mL密度接种于24孔板，每孔1mL,每组设2个复孔，培养过夜。吸弃细胞上清，加入无血清培养液1mL静止24h,使其同步化。弃细胞上清，按分组加入含相应浓度药物的培养液，每孔lmL。分别于24、48、72h收集细胞上清，4°C、2000r/min离心20min,仔细收集上清，-20°C保存待测。指标检测严格按照试剂盒说明书进行。取出细胞上清液，在包被反应条每孔加入不同质量浓度标准品或待测标本100?L,空白对照孔中加入稀释液100?L,37°C孵育、洗涤、加酶标抗体和终止反应。在酶标

7、仪上450nm处，以空白对照孔调零，直接测定各孔0D值及样品浓度值。3统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行分析，数据符合正态分布,结果用一X土S表示，进行方差分析，P