hbv cccdna荧光定量检测方法的建立与新型核苷类抗乙肝病毒化合物体外筛选

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1、郑州大学硕士学位论文HBVcccDNA荧光定量检测方法的建立与新型核苷类抗乙肝病毒化合物体外筛选姓名：杨晓瑞申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：郑立运201205中文摘要HBVcccDNA荧光定量检测方法的建立与新型核苷类抗乙肝病毒化合物体外筛选研究生：杨晓瑞导师：郑立运郑州大学药学院河南郑州450052乙型肝炎病毒(HepatitisBvires，HBV)感染导致乙型肝炎的发生，严重威胁着人类的生命健康。目前的治疗药物存在毒副作用大、价格昂贵、不能完全清除病毒且易产生耐药性等诸多问题。因此，寻找新型的抗HBV药物，成为当前研究的热点。目前认为，HBV共价

2、闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，eccDNA)是乙肝病毒复制的第一中间体，是HBV存在和持续复制的根本原因。因此，开展对HBVeccDNA的定量检测，对于判断HBV在肝细胞内复制的状况具有重要的意义，使之能够更准确的评价抗HBV药物的疗效。本文首先建立了一种HBVcccDNASYBRGreenI荧光定量PCR检测方法；然后应用HepG2．2．15细胞株，采用MTT、ELISA和荧光定量PCR检测方法，对60种新型核苷类化合物进行初步体外筛选，力求获得低毒、高效的抗HBV候选药物。第一部分；HBVcccDNA荧光定量检测方

3、法的建立．旧的】建立一种稳定、特异、敏感的HBVcccDNASYBRGreenI荧光定量PCR检测方法。【方法】根据HBV松弛环状DNA(relaxci咖l盯DNA，rcDNA)与cccDNA的结构差异，设计跨越双缺口的特殊引物，并利用一种ATP依赖不降解质粒的DNA酶(Plasmid．SafeTMATPdependentDnase，PSAD)提高反应的特异性；建立荧光定量PCR标准曲线，并进行特异性、敏感性和重复性检验。应用所建立的方法评价拉米夫定和阿德福韦酯对HBVcccDNA的抑制效果。【结果】该方法能特异性检测到HBVcccDNA，在2．68x108—

4、2．68x103copies／／A检测范围之间有良好的线性关系，相关系数为．1．00，扩增效率为102％；最低检测限为2．68x101copies／／zl。拉米夫定和阿德福韦酯对HBVc优DNA均有很好的抑制效果。【结论】该实验所建立的方法稳定性强、特异性好、灵敏度高，可快速定量检测HBVcccDNA，用于抗HBV药物的评价。中文摘要第二部分：抗HBV化合物体外筛选研究。咀的】从60种新型核苷类化合物中筛选出具有体外抗HBV活性的新型化合物。【方法】选用拉米夫定(3TC)作为阳性药物，通过MTT法检测受试样品对HepG2．2．15细胞的毒性，ELISA法检测样

5、品作用后第3、6、9天细胞上清液中HBsAg和HBeAg的变化，以细胞的半数毒性浓度(Cc50)、半数抑制浓度(IC50)、治疗指数TI(CC50／IC50)为指标，对60个受试样品进行初筛，筛选出具有体外抗HBV活性的样品，然后应用实时荧光定量PCR法检测活性样品对HBVDNA和HBVcccDNA含量的影响，从而对样品的抗HBV活性做出进一步的评价。【结果】(1)对60个受试样品进行初筛，共筛出13个样品的CC50值大于3TC(858．71／tM)。(2)针对毒性较低的13个受试样品，根据毒性测定结果设定合适的筛选浓度，结果显示核苷类化合物GLll0030、

6、GLll0054对HBsAg和HBeAg的分泌具有较强的抑制作用，用药9天的治疗指数均远大于10．0。(3)核苷类化合物GLll0030、GLll0054在1肛M、0．MM、0．01／lfM时，显著影响HepG2．2．15细胞上清中的HBVDNA含量，平均抑制率分别为76．06％、62．15％、54．87％及77．01％、68．68％、53．56％；同时，对HepG2．2．15细胞内的HBVDNA含量也均产生显著影响，其平均抑制率分别为61．92％、51．80％、36．48％和68．00％、60．47％、38．14％。“)GLll0030、GLll0054对H

7、epG2．2．15细胞内cccDNA拷贝数有明显影响，在1肛M、0．1,uM、0．01#M时，细胞内HBVcccDNA含量分别为0．59±0．2x103、3．02±0．43x103、6．06±1．46x103copies／／d及0．56±0．11x103、2．34±0．97x103、5．21±0．87x103copies／gl：与正常对照组13．78±0．78x103copies／／d相比，其含量有明显的下降，差异具有统计学意义(尸<0．01)。【结论】对60个受试样品进行初筛，得出对HepG2．2．15细胞具有较低毒性的样品共13个，其中GLll0030、G

8、Lll0054能显著抑制乙肝病毒抗原、