沙门氏菌特异性靶点的筛选与荧光定量pcr检测方法的建立

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1、DissertationsubmittedforrequirementofMaster’sdegreeSCREENINGOFSPECIFICTARGETSANDDEVELOPMENTOFAREAL-TIMEPCRMETHODFORTHEDETECTIONOFSALMONELLAGraduateJingChenAdvisorProf.XianmingShiMajorFoodScienceShanghaiJiaoTongUniversityShanghai,ChinaJanuary,2010上海交通大学硕士学位论文本研究承蒙国家

2、自然科学基金（No.30771792）和上海市科委研发公共服务平台建设项目（No.071422011）资助iv上海交通大学硕士学位论文沙门氏菌特异性靶点的筛选及荧光定量PCR方法的建立摘要本研究利用生物信息学手段，通过比对沙门氏菌及其他原核生物的基因组序列，发掘出361段沙门氏菌特异性片段作为候选分子检测靶点。从这些序列中随机挑选出30个序列片段，设计普通PCR引物，并用58株沙门氏菌菌株和22株非沙门氏菌菌株对每对引物的检测特异性进行评价，筛选出15对特异性较好的引物。经进一步灵敏度评价，得到6对检测灵敏度较好的引物，分别

3、为：c1（36.5fg/PCR，500cfu/mL）；c3（36.5fg/PCR，500cfu/4mL）；c20（36.5fg/PCR，500cfu/mL）；c23（36.5fg/PCR，5×10cfu/mL）；c24（36.5fg/PCR，500cfu/mL）和plc（36.5fg/PCR，500cfu/mL）。用鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028）人为污染牛奶样品后，用建立好的普通PCR方法进行检测验证，当初始接种菌量为8cfu/25g牛奶时，引物c3，c20，c244和plc均能在增菌6-8小时内检出阳性结果；而严重污

4、染的牛奶样品（>10cfu/25g牛奶）则只需增菌2-4小时即可检出沙门氏菌。在普通PCR方法的基础上，挑选出一段特异性较好的沙门氏菌基因组片段，设计出MGB-TaqMan探针p4以及相应的引物。同时，利用DNA随机重组技术构建扩增内标探针，合成单链寡核苷酸直接作为内标模板，以指示由PCR抑制剂等因素引起的假阴性结果，建立沙门氏菌实时荧光PCR检测方法，并对其特异性、灵敏度、抗干扰性以及在食品样品中的实际检测能v上海交通大学硕士学位论文力进行评价。经40株沙门氏菌和24株非沙门氏菌检测验证，荧光定量PCR具有良好的特异性，以

5、肠炎沙门氏菌（CDCH3526）基因组DNA作为模板，检测灵敏度达到18.6fg/PCR；以鼠伤寒沙门氏菌（CDCG7601）基因组DNA作模版，PCR反应检测灵敏度为40.2fg/PCR。在鸡肉样品中自然存在背景菌群的干扰下，PCR检测限为130cfu/mL，且PCR定量结果与实际接入的沙门氏菌量处于相同或相近水平。用所建立的荧光定量PCR方法检测人工污染至鸡肉样品中的沙门氏菌，当污染量低至5cfu/10g样品时，经6小时非选择性增菌后，检验结果与标准方法符合率为23/24（95.8%）；人工污染液体鸡蛋样品，初始接种量低

6、至1cfu/10g样品时，检出率为100%，并与标准检测方法结果吻合；荧光定量PCR方法对人工污染沙门氏菌的花生酱样品检出率为26/27（96.3%），与标准方法符合率为35/36（97.2%），检测限低至3cfu/10g样品。关键字：沙门氏菌，PCR，靶点，筛选，内标vi上海交通大学硕士学位论文SCREENINGOFSPECIFICTARGETSANDDEVELOPMENTOFAREAL-TIMEPCRMETHODFORTHEDETECTIONOFSALMONELLAABSTRACTInthisstudy361candid

7、atesforSalmonella-specifictargetsweresuccessfullyidentifiedbycomparingthesequencesofSalmonellaentericaandotherprokaryoticgenomesusingbio-informaticanalysis.Primersweredesignedfrom30randomlyselectedfragmentsforend-pointPCRdetection.Thespecificityof15primersetswasver

8、ifiedbytestingagainst58Salmonellastrainsand22non-Salmonellastrains,and6primerpairs,namelyc1(36.5fg/PCR,500cfu/mL);c3(36.5fg/PCR,500cfu/mL);c20(36