猕猴ifn-γ基因的克隆表达及其检测方法的建立

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1、华中农业大学硕士学位论文猕猴IFN--γ基因的克隆表达及其检测方法的建立姓名：姜勇申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：郭爱珍201206猕猴IFN-y基因的克隆表达及其检测方法的建立摘要结核病是一种人兽共患的慢性消耗性传染病，是目前致死亡人数最多的传染病，由结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTC)成员引起。猕猴(Macacamulatta，Mm)为我国II级重点保护野生动物，也是医学研究中具有很高价值的实验动物，在我国分布广泛。非人灵长类是

2、结核病的敏感物种，其中猕猴最为易感。猴群发生结核病，会导致猴群的损失，同时实验猴发生结核分枝杆菌感染会对实验项目产生严重干扰，并可能传染人。目前，尚无有效疫苗预防猕猴结核病，控制猕猴结核病的主要措施是“检疫一扑杀”。因此，一种敏感性和特异性俱佳的猕猴结核病检测方法是实施该措施的前提条件。结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest，TST)是目前最常用的结核病检测方法。此方法操作繁琐，主观性强，假阳性率高。干扰素是一种具有多种生物活性的低分子量糖蛋白，结核分枝杆菌感染能刺激体内免疫细胞产生I

3、FN吖。利用这一原理建立的结核病IFN吖体外释放检测法在发达国家已被广泛用于牛结核和人结核的感染检测。国外也有猴结核IFN吖检测试剂盒。但这些产品均价格高，且货源难得。本研究旨在自主建立猕猴结核IFN-y检测法，为我国猕猴结核的诊断与防控提供技术手段。主要研究内容包括：克隆猕猴IFN。y(MmIFN．Y)基因，进行了原核和真核表达，进一步纯化了IFN-7重组蛋白，制备和筛选了抗MmIFN吖的单克隆抗体；制备了抗MmIFN吖的多克隆抗体。在此基础上建立了检测MmlFN．Y的间接夹心ELISA方法，通过临

4、床样本检测验证了该方法的可行性。1．猕猴IFN．y的克隆与原核和酵母表达根据本实验室保存的猕猴IFN-ycDNA设计一对引物并进行扩增，将MmlFN．v基因克隆至原核表达载体pET-30a，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，结果成功表达出大小为24kDa左右的His．tag．MmIFN-y重组融合蛋白。同时，根据本实验室保存的猕猴IFN吖eDNA设计另一对引物并进行扩增，进一步将MmlFN．Y基因克隆至酵母表达载体pPICZaA，电转化酵母GSll5感受态细胞，经甲醇诱导，结果表达出17kDa的M

5、mIFN吖和约22kDa的糖基化重组MmIFN—Y蛋白。2．猕猴IFN-,,／单克隆抗体、多克隆抗体的制备以及鉴定利用原核表达的MmIFN．1，免疫Balb／C小鼠，用原核表达的MmIFN_丫建立间接ELISA筛选杂交瘤细胞株，获得10株单克隆抗体，分别命名为2A1、2C3、2F6、2H8、3A1、382、3E5、3F6、3G7、3H9。单抗腹水效价在3．2×103(3G7)．6．5×106华中农业大学2012届硕士研究生学位论文(2A1)之间，单抗相对亲和力在104．107之间。间接ELISA表明1

6、0株单抗都能和酵母表达MIIlIFN吖进行反应。利用原核表达的MmlFN吖免疫日本大耳白兔，获得高免血清，经纯化获得兔抗MmlFN-Y多克隆抗体，ELISA抗体效价为5．12×104。3．间接双夹心ELISA方法的建立和应用用2F6株单抗、多抗及HRP标记的羊抗兔IgG，建立检测MmlFN_Y的双夹心ELISA方法。此ELISA方法检测原核表达的MmlFN-y灵敏度达到125pg／mL，同时能检测猕猴天然IFN-y。用该方法检测了7份结核菌素皮试阴性猴的外周血细胞经牛PPD刺激后的培养液，结果全为阴性

7、。检测阴性猴外周血细胞ConA刺激后的培养液，结果为阳性。检测灵敏度为125pg／mL时，其对应OD630值为O．18，相当于7份阴性样本的OD630平均值+3．5SD。一般阳性样本判断值标准为OD630值+2．3SD，因此，推测本试剂盒能够用作猕猴结核病的检测。此外，据报道，结核感染猕猴的全血经PPD刺激后释放的IFN-1,量都在200pg／mL以上。因此，虽然本本研究尚未应用于结核感染阳性猕猴的检测，但所建立的ELISA方法为猕猴结核病的检测和防治奠定了良好基础。关键词：猕猴；IFN叫；结核病；原

8、核表达；酵母表达；单克隆抗体；间接双夹心EI，ISA猕猴IFN-7基因的克隆表达及其检测方法的建立Abs仃actTuberculosis(TB)isazoonotic，cllromcandconsumptiveinfectiousdiseasewiththehighestdeathininfectiousdiseasesofhuman．ItwascausedbyMycobacteriumtuberculosiscomplex(MTC)．Macaque(M