猪链球菌gdh基因克隆表达及其ppa-elisa抗体检测方法的建立与应用

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1、山东农业大学硕士学位论文猪链球菌GDH基因克隆表达及其PPA--ELISA抗体检测方法的建立与应用姓名：夏小静申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：沈志强；姜世金20120612山东农业大学硕士学位论文中文摘要猪链球菌(Streptocuccussuis，S．suis)是当前严重危害养猪业的一种重要病原菌。根据荚膜多糖(capsularpolysaceharide，cps)抗原成分不同，将猪链球菌分为35个血清型(1～34型和l／2型)，其中，猪链球菌2型(Streptococcussuisserotype2，SS2)

2、是最常见、毒力最强的血清型，是一种重要的人畜共患病病原菌。谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase，GDH)是新近报导的毒力相关因子，在细胞表面表达，其酶活性是NAD(P)H依赖型的，是连接碳代谢和氮代谢的一个关键酶，是细菌能量代谢过程中的一个十分重要的功能分子，对细菌致病性有着重要意义。GDH编码的氨基酸序列极其保守，为种特异性抗原成分。本研究选取SC22(Sn广、MRP+、EPF+)株GDH基因克隆入pET-30a进行原核表达，经亲和层析纯化重组蛋白进行动物试验，验证表达重组GDH蛋白的免疫学活性，分别

3、以酶标板和NC膜为抗原载体、rGDH为抗原建立PPA-ELISA及Dot-PPA．ELISA检测方法，以期为大规模地进行猪链球菌病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段。研究内容主要包括以下几部分：1、猪链球菌谷氨酸脱氢酶的原核表达及其抗原性初步研究为获得猪链球菌感染的诊断性抗原，以SS2四川分离株SC22基因组为模板，PCR扩增gdh的完整ORF，将其克隆入原核表达载体pET-30a构建重组原核表达质粒，转化E．coliBL21(DE3)，筛选阳性转化子诱导表达。SDS．PAGE对分析显示，目的蛋白获得高效表达，Ni

4、．Agarose柱纯化重组蛋白纯度高。将纯化的蛋白免疫家兔获得高效价的多克隆抗血清，全部被检菌株与抗GDH血清反应均有单一特异性反应条带，重组GDH能与5份实验感染猪血清产生反应条带。表明大肠杆菌表达的GDH融合蛋白至少保留了部分天然GDH蛋白的反应原性，可作为诊断抗原用于ELISA等诊断方法的建立。2、猪链球菌rGDHPPA-ELISA抗体检测方法的建立与应用以纯化的猪链球菌GDH基因重组原核表达产物作为包被抗原，酶标葡萄糖球菌A蛋白为二抗，建立了检测猪链球菌抗体的间接PPA．ELISA诊断方法。方阵试验确定的GDH蛋白抗

5、原的最适包被浓度为12．5I_tg／mL，血清最佳稀释倍数为80倍，PPA(HRP-SPA)的最适工作浓度为1：4000，ELISA阳性反应的临界值为OD450：≥_0．378，特异性试验表明，所建立的PPA．ELISA不与猪细小病毒病等常见猪病的阳性血清发生交叉反应，批内和批问重复试验的变异系数均小于10％。应用建立的检测方法检测家兔免疫后抗体变化并猪链球菌GDH基冈克隆表达及其PPA．ELISA抗体检测方法的建立与应用绘制抗体消长规律衄线图；用建立的PPA．ELISA方法与武汉科前动物生物制品有限责任公司猪链球菌ELIS

6、A抗体检测试剂盒同时检测120份临床血清，二者总符合率为98．3％；对320份血清进行猪链球菌抗体检测，阳性检出率为73．4％。试验证明，所建立的ELSIA检测法重复性好、特异性强、敏感性高，为大规模地进行猪链球菌病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段。3、猪链球菌rGDHDot-PPA．ELISA抗体检测方法的建立与应用利用原核表达的猪链球菌谷氨酸脱氢酶蛋白(GDH)作为包被抗原建立了基于NC膜条的猪链球菌抗体的间接Dot-PPA．ELISA检测方法。确定抗原最适包被浓度为12．5I．tedmL，PPA(HRP．S

7、VA)的最适工作浓度为1：2000，以5％脱脂奶粉．PBST作为封闭液，37"C封闭1h效果最佳。应用建立的检测方法检测家兔SS抗体；用建立的ELISA方法与武汉科前动物生物制品有限责任公司猪链球菌ELISA抗体检测试剂盒同时检测120份临床血清，二者总符合率为98．3％；对320份血清进行猪链球菌抗体检测，阳性检出率为73．4％。结果表明该方法具有简便快速、特异性强、敏感性高的优点，适用于猪链球菌所有亚型的抗体检测，为猪链球菌病的流行病学调查和疫苗免疫抗体检测提供了一种敏感、特异、简便、快速的血清学检测方法。关键词：猪链球

8、菌；谷氨酸脱氢酶(GDH)；PPA-ELISA；Dot-PPA—ELISA；检测方法H山东农业大学硕士学位论文ExpressionofGeneEncodingtheGlutamateDehydrogenaseandDevelopmentandApplicationofPPA—ELISAfo