hiv1病毒nef基因克隆、 表达、 纯化及其抗体的制备

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1、HIV1病毒Nef基因克隆、表达、纯化及其抗体的制备【摘要】目的:运用基因工程方法制备HIV1Nef重组蛋白及其抗体。方法:用PCR技术从HIV1H×B2质粒中扩增HIV1Nef基因,将测序鉴定过的HIV1Nef基因克隆到原核表达载体pET28a(+)上,应用酶切鉴定、测序、SDSPAGE及HCI,但具有高效的促进病毒复制能力;而在AIDS的早期进展阶段,Nef对CD4分子的下调及病毒的复制保持稳定或者增加的作用。实验结果提示Nef的功能变化与疾病的进展密切相关［4］。用突变Nef基因的病毒感染动物可以破坏病毒的致病作用［5］。

2、应用CD4C/HIV转基因鼠(Tg)动物模型研究HIV全基因、Nef基因及相关突变体,发现Nef是致病的主要因素,Nef主要表达于CD4+T细胞和巨噬细胞/髄样细胞,产生的AIDS样症状表现为细胞凋亡增加,尤其是胸腺和外周血CD4+和CD8+T细胞［6］。这些临床和动物实验资料表明Nef与AIDS疾病发生发展具有明显的相关性。本实验用基因工程技术表达Nef蛋白,并制备抗体,为Nef基因生物学活性研究奠定实验基础。　　1材料和方法　　1.1材料菌株E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、质粒pET28a（+）、血管内皮细胞由本研

3、究所保存。限制性核酸内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶为Fermentas公司产品。鼠源His单克隆抗体(mAb)、HRP标记的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。RPMI1640、胎牛血清、G418、脂质体购于Invitrogen公司。TMB、弗氏佐剂购于Sigma公司。日本大耳朵白兔（6月龄,体质量2kg,雄性）购于湖北省实验动物中心。　　1.2方法　　1.2.1pET28a（+）Nef重组表达质粒的构建与鉴定以HIV1HXB2基因为模板。上游引物为5′CAGGATCCATGGGTGGCAAGT

4、GGTCA3′(引入限制性核酸内切酶BamHⅠ酶切位点),下游引物为5′GGAATTCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTC3′(引入限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切位点)（引物由上海生工生物公司合成）。PCR扩增条件为:94℃变性5min;然后94℃30s,55℃30s,72℃45s,30个循环;72℃10min结束扩增。用BamHⅠ和EcoRⅠ分别双酶切PCR产物HIV1Nef和pET28a（+）原核表达载体。T4DNA连接酶连接过夜,将连接产物转入大肠杆菌DH5α中培养,挑取单克隆提取质粒进行酶切和测序鉴定。　　1.2.2N

5、ef蛋白原核表达与鉴定将构建好的重组质粒pET28a（+）Nef转化到宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,收集的细菌加入SDS凝胶上样缓冲液,100℃煮沸3min,冰浴4min,室温下离心(12000r/min)1min,取20μL进行SDSPAGE电泳。考马斯亮蓝染色后,通过扫描测定表达的产量。I1640(100mL/L小牛血清,100万U/mL青霉素,100mg/L链霉素)培养基常规培养。在12孔板中放入无菌玻片,将稳定表达pCDNA3.1（+）Nef和pCDNA3.1（+）（对照）内皮细胞接种于玻片上,培养48h后取

6、出细胞爬片,用冰冷的PBST洗3次,用丙酮/甲醛(1∶1)固定10min,PBS洗3遍,滴加1∶200稀释的上述兔抗血清,37℃孵育1h,PBST洗3次。用HRP羊抗兔（1∶500）37℃孵育1h,PBST洗3次。DAB染色。漂洗后晾干,用甘油封片,显微镜观察、拍照。　　2结果　　2.1重组表达质粒pET28a(+)Nef的构建应用PCR方法获得HIV1Nef基因片段,经过酶切、连接和转化,获得pET28a（+）Nef的重组质粒。构建的重组质粒pET28a（+）Nef经BamHI和EcoRI双酶切鉴定,得到620bp左右的目的条带

7、,10g/L琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示,与预期大小相同。DNA测序鉴定结果与HIV1H×B2Nef核苷酸序列比对,结果显示Nef片段序列完整且读框正确,进一步表明原核表达载体pET28a（+）Nef构建正确。　　图1重组质粒pET28a(+)Nef的鉴定（略）　　1,2:重组质粒pET28a（+）Nef经BamHI/EcoRI酶切鉴定;M:DNAmarker;3:质粒pET28a（+）经BamHI/EcoRI双酶切.　　2.2SDSPAGE和r约30000处可检测到Nef蛋白的:蛋白marker;1,2:表达菌经IPTG诱导;3

8、:表达菌未经IPTG诱导.　　图3:预染的蛋白marker;1,2:表达菌经IPTG诱导;3:表达菌未经IPTG诱导.　　2.3Nef蛋白的纯化SDSPAGE分析结果表明,表达