hunc93b1基因的克隆、表达纯化及抗体制备

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1、hUNC93B1基因的克隆、表达纯化及抗体制备　　【Abstract】AIM:ToconstructtheprokaryoticexpressionvectorcontaininghUNC93B1gene,theninducetheexpressionofthisgeneandpurifythefusionprotein,andatlastusingtargetproteintomakethespecificandhightiterantibody.METHODS:ThespecificprimersofhUNC93g

2、eneplifiedbyPCR.ThePCRproductnbyvirtueofits(His)6tag.Rabbitsmunedmunologicaladjuvantforspecificantibodypreparation.RESULTS:An1808bplengthfragmentplifiedbyPCR.Thesequenceatchedin1∶64000akesitpossibletodofurtherinvestigationontherelationshipbetUnc93b，鸡的cUnc93b，线虫的u

3、nc93和果蝇的AF145657等具有很高的同源性.线虫的unc93基因对肌肉的收缩和及其共济运动具有重要的作用，当unc93基因发生等位基因的突变时，线虫将发生运动迟缓，并伴发运动的共济失调现象［2］.为研究hUNC93B1基因与人心血管疾病之间的具体机制，我们设计了针对人hUNC93B1的特异性引物，通过PCR的方法扩增得到该基因片段，测序全部正确后亚克隆入原核表达载体，构建了hUNC93B1pRSETA载体.转化入大肠杆菌BL21中，诱导表达并纯化出该蛋白.用表达的蛋白免疫家兔，以获得了特异性和效价都相对

4、较高的多克隆抗血清.　　1材料和方法　　1.1材料质粒pRSETA，感受态细胞BL21和XL10由本校生化教研室提供，PCR引物由北京赛百盛公司合成；人脑cDNA组文库购自Clontech公司，质粒提取和PCR产物胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司；TaqDNA聚合酶，PCRmarker，T4DNA连接酶，pMD18T载体，SacI,HindIII及IPTG均购自大连宝信生物公司.金属螯合亲和层析中所用Ni2+NTA琼脂糖介质购自Qiagen公司；HRP标记的羊抗兔二抗购自SantaCruzBiotechn

5、ology；_030930)，利用PrimerPremier5.0软件，在其编码区的两端设计一对引物，序列：Up为5′GCGAGCTCATGGAGGCGGAGCCGCCGCTC3′；Loin,加入1UTaqDNA聚合酶，在PE2400PCR循环仪中反应，用12g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物.　　1.2.3DNA序列测定和载体构建PCR扩增产物用安徽优晶生物工程公司胶回收试剂盒回收，将回收的目的片段克隆到测序载体pMD18T中，送上海基康公司进行DNA测序.序列测定所用的引物分别是M13r(-48)和M13f(-

6、47).由于目的片段过长，另送一对针对该基因的测序引物，5′CTTCCTGGCCATGCTGCTGGTGC3′和5′GCACCAGCAGCATGGCCAGGAAG3′.用SacI/HindIII双酶切将测序全部正确的hUNC93B1片段从测序载体pMD18T中切下，插入pRSETA表达载体中，构建重组原核表达载hUNC93B1pRSETA.　　1.2.4融合蛋白表达和纯化将重组质粒hUNC93B1pRSETA转化入BL21感受态细胞中，挑选阳性克隆，在LB培养基中（0.1g/L氨苄青霉素）培养过

7、夜，取50μL菌液转接5mL含氨苄青霉素的LB中，培养大约3h后，待A600nm值达0.4~0.5时加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导表达，继续培养5h后，收取菌体（-70℃冻存）.加入裂解缓冲液（NaH2PO450mmol/L,NaCl300mmol/L,1mmol/LPMSF,pH8.0）,超声裂菌（输出频率为65Hz,4℃,6次，每次10s）,离心（12000r/min,4℃,50min）.分别取适量上清和沉淀进行SDSPAGE，分析目的蛋白的分布情况.用金属螯合亲和层析法纯化目的蛋白.　　1.2.5家兔抗

8、人hUNC93B1抗血清的制备及效价检测取纯化后的蛋白样品定量，分别以1mg/kg蛋白样品加入1mL弗氏完全佐剂初次免疫3只家兔（背部皮下多点注射，下同），14d后以0.5mg/kg蛋白样品加入1mL弗氏不完全佐剂加强免疫，以后每10d加强免疫一次，于第4次加强免疫后7d取家兔血清，纯化后的蛋白样品以5×10-3g