hiv1病毒nef基因克隆、 表达、 纯化及其抗体的制备

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1、HIV1病毒Nef基因克隆、表达、纯化及其抗体的制备【摘要】目的:运用基因工程方法制备HIV1Nef重组蛋白及其抗体。方法:用PCR技术从HIV1H×B2质粒中扩增HIV1Nef基因,将测序鉴定过的HIV1Nef基因克隆到原核表达载体pET28a(+)上,应用酶切鉴定、测序、SDSPAGE及Westernblot等方法鉴定基因片段的正确性及表达蛋白的特异性。纯化的重组蛋白免疫兔3次后,ELISA法测定兔多克隆抗体滴度。用其制备的多克隆抗体通过免疫组织化学方法测定表达Nef基因的内皮细胞。结果:成功地构建了N

2、ef基因的原核表达质粒,测序证明HIV1Nef基因全长为621bp,编码206个氨基酸。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白为包涵体的形式。HIV1Nef蛋白N端融合6×His标签便于纯化及鉴定。获得的高纯度HIV1Nef融合蛋白,免疫动物后,可产生特异的高滴度抗体（ELISA滴度达1∶10000）。将转染Nef基因的内皮细胞,应用免疫组化的方法证明其抗体有高度的特异性。结论:构建了高表达HIV1Nef蛋白的原核表达系统,制备的Nef重组蛋白免疫动物,获得了特异、高效价的抗体,为研究Nef基因的生物

3、学活性提供了实验材料和依据。【关键词】HIV1Nef基因表达抗体病毒　　人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,11HIV)的早期基因负调控因子（negativeregulationfactor,Nef）是HIV1调节蛋白之一。在HIV/AIDS的致病中可能具有重要作用。临床研究表明,在HIV感染长期不发病(LTNP)/病程进展缓慢的患者（SP）Nef基因产生突变或者缺失［1-3］,研究不同AIDS阶段Nef的生物学特点发现在疾病的晚期阶段,Nef不能有效地下调MHCI,但具有高效的促

4、进病毒复制能力;而在AIDS的早期进展阶段,Nef对CD4分子的下调及病毒的复制保持稳定或者增加的作用。实验结果提示Nef的功能变化与疾病的进展密切相关［4］。用突变Nef基因的病毒感染动物可以破坏病毒的致病作用［5］。应用CD4C/HIV转基因鼠(Tg)动物模型研究HIV全基因、Nef基因及相关突变体,发现Nef是致病的主要因素,Nef主要表达于CD4+T细胞和巨噬细胞/髄样细胞,产生的AIDS样症状表现为细胞凋亡增加,尤其是胸腺和外周血CD4+和CD8+T细胞［6］。这些临床和动物实验资料表明Nef与AIDS疾病发

5、生发展具有明显的相关性。本实验用基因工程技术表达Nef蛋白,并制备抗体,为Nef基因生物学活性研究奠定实验基础。　　1材料和方法　　1.1材料菌株E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、质粒pET28a（+）、血管内皮细胞由本研究所保存。限制性核酸内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶为Fermentas公司产品。鼠源His单克隆抗体(mAb)、11HRP标记的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。RPMI1640、胎牛血清、G418、脂质体购于Invitrogen公司。TM

6、B、弗氏佐剂购于Sigma公司。日本大耳朵白兔（6月龄,体质量2kg,雄性）购于湖北省实验动物中心。　　1.2方法　　1.2.1pET28a（+）Nef重组表达质粒的构建与鉴定以HIV1HXB2基因为模板。上游引物为5′CAGGATCCATGGGTGGCAAGTGGTCA3′(引入限制性核酸内切酶BamHⅠ酶切位点),下游引物为5′GGAATTCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTC3′(引入限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切位点)（引物由上海生工生物公司合成）。PCR扩增条件为:94℃变性5min;然后9

7、4℃30s,55℃30s,72℃45s,30个循环;72℃10min结束扩增。用BamHⅠ和EcoRⅠ分别双酶切PCR产物HIV1Nef和pET28a（+）原核表达载体。T4DNA连接酶连接过夜,将连接产物转入大肠杆菌DH5α中培养,挑取单克隆提取质粒进行酶切和测序鉴定。　　1.2.2Nef蛋白原核表达与鉴定将构建好的重组质粒pET28a（+）Nef转化到宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,收集的细菌加入SDS凝胶上样缓冲液,100℃煮沸3min,冰浴4min,室温下离心(12000r/min)1min

8、,取20μL进行SDSPAGE电泳。考马斯亮蓝染色后,通过扫描测定表达的产量。Western11blot检测重组Nef蛋白,SDSPAGE电泳后转移硝酸纤维素膜,用50g/L脱脂奶粉封闭;加抗HisTag鼠源mAb(1∶200)室温轻摇作用2h;TBST洗涤3次;加入HRP标记的羊抗小鼠IgG(1∶2000)室温反应2h,同