清开灵注射液致小鼠ige介导的过敏反应模型建立与绿原酸变应原性研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文清开灵注射液致小鼠IgE介导的过敏反应模型建立与绿原酸变应原性研究Thestudyonmodelingamurinemodelofimmunoglobulin·-E(IgE)-·mediatedQingkailinginjectionanaphylaxisandtheallergenicityofchlorogenicacid课题来源：国家自然科学基金重大研究项目(90709046)；广东省科技计划项目(20078031402006)专业名称药剂学学位申请人指导教师廖国平张忠义主任药师汪艳主任药师答辩委员会主席刘中秋教授答辩委员会成员葛发欢教授张军

2、教授陈吉生教授杨威教授论文，评阅人于荣敏教授苏薇薇教授2012年5月25曰广州硕士学位论文清开灵注射液致小鼠IgE介导的过敏反应模型建立与绿原酸变应原性研究硕士研究生：廖国平指导老师：张忠义主任药师汪艳主任药师摘要清开灵注射液具有清热解毒、化痰通络、镇静安神和醒脑开窍的功效，在临床上使用广泛。但随着临床应用日益增多，清开灵注射液的不良反应报告也逐渐增加，不良反应主要表现为用药30min内即可发生药物热、皮肤反应或过敏性休克，其中重症过敏反应严重限制了清开灵注射液的临床应用。因此，找出清开灵注射液中致重症过敏反应的主要物质，是保障清开灵注射液安全使用的关键。目前，国内学者对清开灵注射

3、液致类过敏反应研究较为透彻，初步发现了栀子、金银花提取物和胆酸可能是引起类过敏反应的物质；而清开灵注射液致IgE介导的过敏反应仍处于初级阶段，仅仅建立了一些简单的BN大鼠速发过敏模型；不少学者通过碳二亚胺法制备绿原酸完全抗原，发现绿原酸可能可以作为一种半抗原引发免疫应答，还有不少学者则认为绿原酸并非半抗原，而是其中的杂质物．异绿原酸为半抗原，显然，仅有一种偶联方法并不足以说明绿原酸具有变应原性。因此，本研究拟对清开灵注射液致IgE介导的过敏反应动物模型进行深入研究，并利用建立此模型的技术路线对具有争议性的绿原酸进行变应原性验证研究，为筛查出清开灵注射液中致重症过敏反应的主要物质、保

4、障清开灵注射液安全使用奠定基础。中文摘要目的：1建立清开灵注射液致Balb／c小鼠IgE介导的过敏反应模型，为后续筛查清开灵注射液中致重症过敏反应的主要物质奠定基础。2利用建立IgE介导的过敏反应动物模型的技术路线对绿原酸进行变应原性研才寸九O方法：1清开灵注射液致Balb／c小鼠IgE介导的过敏反应模型的建立(1)阳离子化牛血清白蛋白(cBSA)的制备及鉴定：将牛血清白蛋白(nBSA)、EDA和EDC按照相关合成方法制备cBSA，然后采用阳离子交换法对完全抗原进行分离纯化，同时辅以紫外分光光度法(UV-Vis)和红外光谱法(FT-IR)进行鉴定。(2)清开灵一cBSA完全抗原的制

5、备及鉴定：利用Mannich反应将清开灵注射液冻干粉偶联至cBSA上制备完全抗原，然后采用阳离子交换法对完全抗原进行分离纯化，同时辅以UV-Vis和FT-IR进行鉴定。(3)清开灵．cBSA完全抗原刺激Balb／c小鼠实验：将18只Balb／c小鼠随机分成3组：清丌灵．cBSA偶联物+铝佐剂(实验组)，OVA+铝佐剂组(阳性对照组)，生理盐水组(阴性对照组)。实验组多点皮下注射0．3mL偶联物与佐剂的混合物(含0．05mg偶联物)，其他组以等剂量多点皮下注射。在初次免疫后第14d、21d、28d、35d，以相同剂量皮下注射加强免疫，每次加强免疫后30min内观察小鼠体征表现，参照相

6、关标准进行评分统计，同时眼后眦静脉采血约0．5ml，分离出来的血清．20℃储藏，用于血清中组胺和总IgE的含量测定。第35d取实验组、生理盐水组小鼠全血并解剖，将肺组织置于10％的甲醛中，用于病理切片检查。(4)小鼠血清中总IgE、组胺的含量测定：将各时间点的小鼠血清按照试剂盒说明书进行IgE、组胺含量测定，然后采用One．WayANOVA方法，比较不同组别间是否有差异。(5)小鼠肺部组织病理切片观察：将肺组织用10％甲醛固定，然后包埋于石蜡中，切片成5ul厚，再用H&E染色，最后置于100X电镜下拍照。2绿原酸变应原性研究硕士学位论文(1)阳离子化牛血清白蛋白(cBSA)的制备及

7、鉴定：将牛血清白蛋白(nBSA)、EDA和EDC按照相关合成方法制备cBSA，然后采用阳离子交换法对完全抗原进行分离纯化，同时辅以UV-Vis、FT-IR和基质辅助．激光解吸．飞行时间质谱(MALDI．TOF—MS)法进行鉴定。(2)绿原酸一cBSA完全抗原的制备及鉴定：利用Mannich反应将绿原酸偶联至cBSA上制备完全抗原，然后采用阳离子交换法对完全抗原进行分离纯化，同时辅以UV-Vis、FT-IR和MALDI．TOF．MS法进行鉴定。(3)绿原酸．cBSA完全