xenorhabdus budapestensis d43菌株杀虫蛋白的分离纯化及致病机理的研究

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1、安徽农业大学博士学位论文XenorhabdusbudapestensisD43菌株杀虫蛋白的分离纯化及致病机理的研究姓名：杨君申请学位级别：博士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：林华峰201206摘要昆虫病原线虫共生菌是一种重要的微生物资源，它能够产生多种具有杀虫、抑菌、抗肿瘤等功能的代谢产物，在农业和医药卫生领域显示出巨大的开发潜力和应用前景。特别是昆虫病原线虫共生菌能够产生多种杀虫蛋白，不仅可以直接作为蛋白质农药，而且能够为转基因抗虫植物和杀虫工程菌株的发展提供更多新颖的基因资源。本研究以从中国东北土壤样品获得的拟双角斯氏线虫中分离的共生茵娩刀

2、D砌口6加6删劬船纪邶西D43为试验材料，对该菌株细胞内的蛋白进行了纯化和筛选，并对筛选到具有杀虫活性的蛋白进行了鉴定、基因克隆、序列生物信息学分析、重组蛋白的表达和纯化，以及致病机理等方面的研究，得出主要研究结果如下：l、昆虫病原线虫共生菌X6”却甜地淞括D43菌株细胞内含有大量的蛋白种类，本研究利用制备型凝胶电泳的方法成功纯化到4种，其中一种对大蜡螟幼虫具有血腔注射活性，命名为HIP57。生物测定结果显示，该蛋白对5龄大蜡螟幼虫的LD50为206．8ln∥头；当以不低于490n∥头的剂量注射时，试虫体色会在15min之内变黑，48h死亡率为10

3、0％。2、经过双向电泳分析和质谱鉴定，HD57的分子量约为60kDa，等电点和5，与GroEL蛋白具有较高同源性。GroEL虽为分子伴侣，但在本研究中，来自于共生菌X6“却嚣纪凇括D43菌株的H口57显示出杀虫功能。克隆获得H口57基因全长l647bp(GenBallkaccessionno．Ⅲ863588)，编码548个氨基酸残基(GellBankaCcessionno．AEUl0771)。3、生物信息学分析结果显示，H口57蛋白的相对分子量为57379．7Da，理论等电点为4．77，与电泳结果相吻合；该蛋白序列中不含信号肽，属于稳定的水溶性蛋白

4、；同时采用4种不同的预测原理分析了Hm57的二级结构，特别是运用同源模建构建了精确度较高的HIP57蛋白三级结构；通过HⅢ57蛋白与其他4种同样来源于昆虫病原线虫共生菌的GroEL蛋白进行序列比对发现，该蛋白拥有一些特有的氨基酸残基；根据GroEL蛋白氨基酸序列的同源性，本研究成功构建了43种肠杆菌科细菌的系统发育树，将X6“却缈把珊西D43聚类至致病杆菌属，显示出GroEL蛋白序列具有在细菌分类学和进化学应用的潜在性。4、对HP57、GFP和HP57一GFP进行了原核表达，同时获得了纯度较高的3种重组蛋白。经west锄blo地g分析，这些重组蛋白

5、与其相应的抗体都能够发生特异性结合。与天然HD57蛋白引起试虫通体黑化现象和高致死活性相比，HP57和GFP重组蛋白没有显示出这样的功能；而H口57．GFP重组蛋白虽不对试虫具有致死活性，但是能够引起试虫体内出现大量的黑色结节。5、HⅢ57蛋白对大蜡螟幼虫致病机理的研究结果包括：其一，HIP57能够引起大蜡螟幼虫强烈的免疫反应，包括P0活力显著升高，血细胞数量显著降低，以及血细胞包囊反应；其二，大蜡螟注射HD57后，有23种血淋巴蛋白的表达量发生显著变化，其中4种获得成功鉴定，分别为ApoLp．III、Se印in、P27K和GST；其三，捕获2种与

6、HP57具有潜在结合作用的血淋巴蛋白，分别为芳基贮存蛋白和B．1，3．葡聚糖识别蛋白前体。虽然在昆虫病原线虫共生茵复合体侵染寄主昆虫过程中，Hm57是否被分泌的问题本研究未能给出答案，但H口57显示出非常高的致病性，如果在昆虫病原线虫共生菌复合体致病过程中能够被分泌到寄主血腔中，应为一种重要的致病因子；即便在线虫共生菌致病过程中不能分泌到寄主血腔，HIP57作为一种拥有较高致病性的蛋白，其研究价值和应用潜力仍然十分值得关注。本研究结果不仅为揭示HIP57蛋白的杀虫机理奠定了基础，而且为该蛋白的合理利用提供了理论依据。关键词：昆虫病原线虫共生茵，杀虫

7、蛋白，纯化，致病机理，大蜡螟IIALbs缸．actT11e饥tomop砒ogenicbacteria's灿ioticallyaSsociate谢mdi行erent‰iliesofnematodes，hasbeeIldes酬bedtoproducear趾geofmetabolitcsthathaveinse出cidal，antibact舐al，anticancer枷vi吼andsoon．Atpresent，mesebaCt耐ahaVebeenreg莉edaSaIlinlportantmicrobialresourCe趾dhavehugedcvelop

8、mentpot训al强d900dapplicationprospect．Inp枷cular，entomopatllogen