嗜线虫致病杆菌CB6菌株杀虫蛋白的活性及其分离纯化

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1、西南农业大学硕士学位论文嗜线虫致病杆菌CB6菌株杀虫蛋白的活性及其分离纯化姓名：李明华申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：王中康;简恒2003.5.1西南农业大学2003届硕士学位论文摘要昆虫病原线虫共生菌是寄生于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌，与线虫互惠共生。该类细菌分致病杆菌属(Xenorhabdus)和光杆状菌属(Photorhabdus)两个属，属下共有6个种。共生菌对昆虫具有极强的致病力，大部分菌株具有血腔活性，LD50仅为1_10个活细胞。国内外科研工作者已分离到了具有杀虫活性的脂多糖、蛋白质等化合物，并发现共生菌杀虫蛋白杀虫谱宽、杀虫活性强，

2、是极具应用潜力的生物杀虫剂。昆虫病原线虫共生菌杀虫蛋白已成为国内外研究的热点。、+≥、-本妍究选取了11个菌株为实验材料，通过对菌悬液的生物测定，筛选得到了一，、株高毒力的菌株，为采白北京郊区的嗜线虫致病杆菌(X．nematophila)CB6菌株。论文确定了本菌株具有杀虫活性的物质为蛋白质，测定了其生物活性，最后分离纯化得厂到杀虫蛋白纯品^I现将主要研究结果总结如下：。t1．比较了11个菌株菌悬液的杀虫活性。结果表明，不同菌株对棉铃虫初孵幼虫的活性不同，其中CB6、A54、Dan和4-Ps菌株的活性较高，生长抑制率分别为99．48％、89．49％、83．80

3、％和73．54％。而NC34、Wh03和E一6—7等菌株活性较低，生长抑制率分别为．9．57％、26．23％和28．64％，各菌株对棉铃虫幼虫的致死率都很低。2．确定了CB6菌株发酵液中具有杀虫活性的物质为蛋白质。菌体细胞60。C力[1热10min致死后，对棉铃虫的生长抑制率与未处理样品无差别，100"C处理后活性则完全丧失。发酵上清液经过沸水浴加热或胃蛋白酶降解后，活性大大降低，在40“Fg饲料的浓度时，生长抑制率分别降低74．51％和67．01％。细胞经洗涤、超声波破碎后提取上清液，用同样的方法处理，活性同样明显下降，在40pYg饲料的浓度，下降87．13

4、％和59．14％。由此可见，CB6菌株杀虫物质对热和胃蛋白酶敏感，说明这种物质为蛋白质。3．测定了杀虫粗蛋白对棉铃虫生长发育和取食的影响。杀虫粗蛋白对棉铃虫致死率较低，但却有极高的生长抑制率，并明显延长幼虫历期，严重影响幼虫的化蛹及蛹的羽化。叶碟法试验表明，该杀虫蛋白对棉铃虫高龄幼虫拒食效果明显，选择嗜线擞致病抒蓥CB6菠探杀虫蛋巍瓣活性及其分建纯纯性拒食率和非选择性拒食率都较高。4．分离纯化了CB6藏株胞外杀搬蛋白。发酵液离心除去蘸体后，在上溥液加入(NH4)zS04分段魏耩，然磊±DEAE—SepharoseFastFlow离子交换耱鼷辑，褥列3个鬣白峰，

5、将具有活性的蛋白峰浓缩后荐缀过SephadexG-200过滤艨析，得到了分子量大于670kDa的蛋白旗缝最，在284nm盼波长下舆育最大吸收峰。生测结巢袭疆，杀虫蛋巍对热敏感，活经受酸碱液静影嫡不大，在pH5．8辩活性较高，对胃鬣白酶和蛋白酶K较敏感，而活性却不爨胰蛋白酶的影响。磺突绫聚表硬，CB6蘩撩发酵滚孛吴毒杀虫潺往戆豹矮必爱鑫震，该耱矮鑫矮罗重影响棉铃虫幼虫的取食和生长发宵，具有较高的生物活性。本文为进一步研究该菌株杀虫蛋白的理化性质及该杀虫蛋囱基因的克隆提供了依据_j}H蒸础≯}—芬F一，／V关键词：嗜线虫致病杆菌；杀虫蛋白毫燃趱；生型敞2西南农业大

6、学2003瘸硕士学使论文BioactivityandPurificationofInsecticidalProteinfromXenorhabdusnematophilaCB6Candidate：LiMinghuaAdvisor：Pro．WangZhongkangi，Pro．JianHen92f1．CollegeofPiantProtection，SWAU,Chongqing400716,China2．．InstituteofBiologicalControl，CAAS,Beijing100081，China)AbstractXenorhabdusandPho

7、torhabdusaleentomopathogenicbacteriasymbioticallyassociatedwithentomopathogenicnematodes，sixspeciesincluded．Theyalehighlyvirulenttoimects．LDs0isgenerally1-10livecellswheninjectedintothehemoeoelsofinsects．Researchersintheworldhavepurifiedlipopolysaccharideandproteinfromcellsandsupema

8、tantoffermentationc