嗜线虫致病杆菌xnpt毒素酶解特性的研究

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1、河北农业大学硕士学位论文嗜线虫致病杆菌Xnpt毒素酶解特性的研究姓名：杨云艳申请学位级别：硕士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：王勤英20120526摘要嗜线虫致病杆菌XenorhabdusnematophilaHB310(XnHB310)是与小卷蛾斯氏线虫(Steinernemacarpocapsae)共生的细菌，分离自河北省土壤中。该菌对多种农业害虫具有广谱的杀虫活性或抑制生长发育的作用，其杀虫活性组份为蛋白复合物(简称Xnpt毒素)。前期实验通过制备型非变性凝胶电泳对胞内杀虫蛋白进行了分离和纯化，得到了具

2、有胃毒杀虫活性的两种蛋白毒素复合物(Xnptl和Xnpt2)，Xnptl蛋白毒素复合物主要由XptAl、XptBl和XptCl三种蛋白组成，对菜青虫(Pierisrapae)具有较强的杀虫活性，而Xnpt2蛋白毒素复合物主要由XptA2、XptBl和XptCl组成，对小菜蛾(Plutellaxylostella)和棉铃虫(Helicoverpaarmigera)具有较强的杀虫活性。为了探索嗜线虫致病杆菌Xnpt毒：素的杀虫机理，本文研究了Xnpt毒素在昆虫中肠内的酶解特性，同时对酶解产物进行了质谱鉴定分析。另外

3、，在实验室条件下对嗜线虫致病杆菌与苏云金芽胞杆菌杆菌Bacillusthuringiensis(Bt)的交互抗性以及协同增效作用进行了初步研究。主要结果如下：1．SDS．PAGE分析显示，菜青虫、棉铃虫、粘虫(Mythimnaseparate)、美国白蛾(Hyphantriacunea)以及斜纹夜蛾(Prodenialitura)幼虫中肠液均能离体酶解Xnpt毒素(Xnptl与Xnpt2混合物)和Xnpt2毒素，其24h酶解效果无显著差异，酶解后均出现了113kDa与60kDa的新蛋白条带。市售胰蛋白酶同样能酶

4、解Xnpt及Xnpt2毒素，并且酶解产物中也出现了约113kDa与60kDa的新蛋白条带，而市售胃蛋白酶、蛋白酶K对Xnpt和Xnpt2均无酶解作用。这些结果初步说明不同敏感性昆虫中肠酶液中对Xnpt2及Xnpt起酶解作用的蛋白酶可能是胰蛋白酶。对113kDa与60kDa的酶解蛋白条带进行质谱鉴定，结果表明，113kDa与60kDa的酶解蛋白条带与Xnpt2中的XptA2蛋白高度匹配，故推测这两个酶解片段均为XptA2蛋白的酶解产物。2．以小菜蛾和棉铃虫幼虫为试虫，测定了Xnpt毒素经不同昆虫中肠酶液和蛋白酶处

5、理24h前后的杀虫活性的变化，发现酶解后的Xnpt毒素仍保持原有的杀虫活性，推测XptA2蛋白在昆虫中肠内有与BtCry蛋白毒素类似的酶解过程，可能XptA2蛋白作为无活性的原毒素需要被昆虫中肠内的胰蛋白酶降解成更小的有活性毒素。3．用BtHD．73对小菜蛾敏感品系(DBM．S)在室内进行抗性筛选，获得了抗性指数为105．43的抗性种群(DBM—R)，该抗性种群对BtHD．1也具有一定的抗性，抗性指数为30．70。在此基础上测定了嗜线虫致病杆菌HB310菌液对小菜蛾敏感种群和抗性种群的杀虫毒力，结果表明，XnH

6、B310菌液对抗性种群小菜蛾的抗性指标为0．92，表明XnHB310与BtHD．73之间没有交互抗性。增效作用测定结果表明，BtHD．73对XnHB310具有增效作用，而XnHB310对BtHD一73没有明显的增效作用。关键词：嗜线虫致病杆菌；Xnpt毒素；中肠酶液；酶解作用；Bt；交互抗性；增效作用StudyontheproteolyticpropertiesofXnpttoxincomplexesfromXenorhabdusnematophilaMastercandidate：YangYunyanSupe

7、rvisor：ProfessorWangQinyingMajor：AgriculturalInsectandPestControlAbstractXenorhabdusnematophilaHB310《狮HB310)，screenedinourlaboratory,iSinsectpathogenbacteriasymbioticallyassociat—edwithentomopathogenicnematode&einernemacarpocapsae．XnHB310hadhighandbroadspect

8、ruminsecticidalactivity,andproducestheinsecticidaltoxincomplexproteins(Xnpt)．TwoXnpts(XnptlandXnpt2)werepurifiedfromtheintracellularproteinofXnHB310bynative—PAGEinthepreliminaryresearch．TheXnptl