产肠毒素性大肠杆菌致病特性及益生菌的筛选与疾病控制研究

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1、厦门大学硕士学位论文产肠毒素性大肠杆菌致病特性及益生菌的筛选与疾病控制研究姓名：朱红梅申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：周涵韬20060701摘要摘要产肠毒素性大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacolL，ETEC)是一类引起人和幼苗(初生仔猪、犊牛、羔羊)腹泻的重要病原菌，初生幼畜被ETEC感染后，常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡，发病率和死亡率均很高，给养殖业带来严重的经济损失。目前，通过在饲料中添加抗生素进行防治是一条最主要的途径。但近些年来，抗生素的由于耐药性、安全性等问题遭到了广泛的置疑和反对，世界上很多国家都对饲

2、料中添加抗生素实行了禁用或限用。益生素(Probiotics)由于“无毒”、“无抗药性”、“无残留”、“无副作用”的特点，逐渐成为国内外饲料添加剂研究的热点。本文利用绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein)标记技术研究ETEC致病特性及筛选益生菌在体内、体外进行抑制致病菌研究，主要结果如下：1．通过电击转化法，将带有gfp]f示；记基因的pGLO质粒成功转化到产肠毒素性大肠杆菌K88qa，经过紫外检测及荧光显微镜检测均发现标记菌株发出绿色荧光。进一步通过分子鉴定、脂肪酸分析、血清学鉴定发现标记菌株和原始菌株没有差异。同时研究在不同微生物学

3、培养条件如：湿度、pH值、盐浓度培养条件下，标记菌株的生长状态和原始菌株一致。2．建立小白鼠K88、K88．GFP攻毒模型，K88的LD50为5．53)(108CFU／mL，K88-GFP的LDsn为4．86×108CFU／mL。同时利用标记菌株自发荧光的特点研究感染K88一GFPd,白鼠的各器官致病菌的定植情况，发现在肝、肾中细菌最多，同时在脑、肌肉中也有少量分布。并且分析感染K88的小白鼠的血液成分、血生化指标的变化。K88对白细胞及相关指标的影响较大，WBC、W—SCC、W—LCC显著降低；对红细胞及相关指标的影响较小，仅在6hRBC、HCT、HGB降低

4、：对血小板也有影响，PLT显著下降，MPV有所升高。K88对血液生化指标中反应肝、肾功能的指标影响较大，ALT、AST和BUN、UA显著升高，而对反应脂代谢的指标无影响，TCHO、TG与对照组相比无差异。3．从土壤中筛选到的一株芽孢杆菌对K88、鸡大肠杆菌、沙门氏菌有抑制作用，通过对其表型特征、生理生化特征、脂肪酸分析和16SrDNA序列分析的多相分类研究，初步确定该菌株为短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)。摘要4．在研究发酵动态对PBJK一2体外抑制K88、K88一GFP的影响时发现，30℃、pH值7．5、发酵24h的原液，同时接入PBJK

5、-2的抑菌效果最好。在对感染K88．GFP的小白鼠模型的疾病控制研究时发现，腹腔注射PBJK．2的小白鼠LD50是不添加PBJK一2的对照组LD50的1．34倍，延缓了小白鼠的死亡，具有一定的保护作用。由此可见，短芽孢杆菌PBJK．2在体内、体外都能对K88起到抑制作用。本文表明利用GFP标记技术可以方便地检测K88一GFP在小白鼠体内的各器官定植及致病情况，为研究ETEC致病特性提供一种有效工具。研究表明致病菌可能具有侵袭性可以感染多种器官，感染的小白鼠血液组分中红细胞、白细胞及相关指标降低，与对照组有显著差异并且通过对血液生化指标研究发现对肝、肾功能有严重

6、损坏。同时，从土壤中筛选到一株短芽孢杆菌PBJK-2，研究发现对K88体内、外都有抑制作用，这对开发益生菌新品种、了解益生素与致病菌的互作机理有具有重要的理论和实践意义。关键词：产肠毒素性大肠杆菌；绿色荧光蛋白；益生素。AbstraetAbstractEnterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC)isoneofthemostimportantpathogenicbacteriainhumanandanimals(postweaningpiglets，calves，lambs)．Neonatalanimalsoftendiefromdi

7、arrheaanddehydrationafterinfectedETEC．Thediarrheaisresponsibleforeconomiclossesduetomortality,morbidity,decreasedgrowthrate，andcostofmedication．Atpresent，theeffectivewaytotreatthisdiseaseistoaddantibioticstothefeed．butitiscontroversialandaversebecauseoftheproblemofthebacteriawithres

8、istancetoantibiotic