il-17对小鼠心肌细胞中单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

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1、郑州大学硕士学位论文IL--17对小鼠心肌细胞中单核细胞趋化蛋白－－1表达的影响姓名：刘艳月申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：沈燕201205中文摘要IL-17对小鼠心肌细胞中单核细胞趋化蛋白一1表达的影响背景与目的研究生刘艳月导师沈燕郑州大学第一临床学院河南郑州450052摘要心肌炎是以心肌细胞的变性、坏死及单个核细胞浸润为特征的一种炎症疾病。心肌炎可由多种病因引起，其中最常见的是病毒感染引起的病毒性心肌炎(viralmyocarditis，VMC)。近年来VMC的发病呈上升趋势，严重威胁人们的生命健康。VMC的发病机制目前还不完全清楚，通常认为在病毒感染初

2、期，病毒可直接侵害心肌，但严重的慢性持久的心肌病变主要是由自身免疫介导的。Thl7是新近发现的CD4+T辅助细胞亚群，IL．17是Thl7细胞分泌的前炎性细胞因子。IL．17可以通过诱导其他炎症因子的表达，介导炎症细胞到局部的浸润及组织损伤，在炎症性疾病尤其是自身免疫性疾病中发挥重要作用。单核细胞趋化蛋白．1(monocytechemoattractantprotein．1，MCP．1)是最早发现的CC类趋化因子家族的成员，MCP．1对单核细胞有很强趋化活性，有关其在炎症性疾病中的作用一直很受人们关注，有研究显示，MCP．1是诱发VMC心肌组织炎症细胞浸润的重要机制之一。I

3、L．17可通过诱导多种细胞产生MCP．1来介导单个核细胞迁移，参与炎症反应，且Thl7细胞及IL．17被证实与VMC的发生和发展密切相关，但对于IL．17是否可以通过诱导心肌细胞MCP．1的表达来介导中文摘要炎症细胞向心肌组织的浸润而参与VMC的病程发展尚未见文献报道。本研究首先检测心肌细胞是否存在IL．17受体(Interleukin．17receptor，IL-17R)的表达，在确定心肌细胞为IL．17靶细胞的前提下，进而研究IL．17对原代培养的小鼠心肌细胞中MCP．1表达的影响，为揭示IL．17和MCP．1在VMC中的作用机制提供实验依据。方法(1)差速贴壁法分离乳

4、鼠心肌细胞进行原代培养。(2)采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测心肌细胞中ILl7RAmRNA的表达情况，对RT-PCR扩增产物电泳后进行灰度扫描，半定量分析心肌细胞中MCP．1mRNA表达的变化。(3)采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测心肌细胞培养上清中MCP．1蛋白的表达情况。(4)实验分组：实验设有IL-17处理组、IL．17+抗．IL．17单克隆抗体处理组、IL广17+同型IgG对照组和空白对照组4组：并且设有IL．17处理的量效组和时效组各6组；实验均重复3次。(5)用SPSSl7．0软件对数据进行统计学分析，实验数据用均数±标准差表示，组问比较采用单因

5、素方差分析，检验水准a=0．05。结果(1)成功实现乳鼠心肌细胞的原代培养，经形态和搏动观察，确定心肌细胞的纯度>95％。(2)利用IL一17RA的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳后检测到目的条带，表明心肌细胞中有IL．17RA的基因表达。(3)以终浓度50ng／mLIL．17处理心肌细胞8h，结果表明MCP．1mRNA和蛋白的表达均升高，同空白对照组相比差异均有统计学意义(尸<0．05)；以终浓度50ng／mL的IL．17和10rtg／mL抗．IL-17单克隆抗体共同处理心肌细胞，结果发现MCP．1mRNA和蛋白的表达同空白对照组相比差异无统计学意义俨>0．05)

6、，而IL一17(50ng／mL)和同型IgG(1099／mL)对照组MCP．1mRNA和蛋白的表达均升高，同空白对照组和IL．17+抗．IL．17单克隆抗体处理组相比差异II中文摘要有统计学意义(P<0．05)，而与IL一17处理组相比差异无统计学意义(P>0．05)，说明抗．II_,-17单克隆抗体可以完全抑制IL．17对心肌细胞MCP．1的诱导作用，IL．17上调心肌细胞MCP．1的表达具有特异性。(4)以终浓度分别为l，5，10，50，100ng／mL的IL．17刺激心肌细胞24h，MCP．1mRNA和蛋白的表达基本呈浓度依赖式升高，且各浓度组与不加刺激因子的对照组相

7、比差异有统计学意义俨<0．05)；以终浓度为50ng／mL的IL．17分别刺激心肌细胞2，4，8，12，24h，发现心肌细胞MCP．1mRNA的表达量在IL．17作用4h时达到高峰，随后开始下降，而心肌细胞培养上清中MCP．1蛋白的量呈时间依赖式升高，且各时间组与空白对照组相比有显著性差异(P<0．05)。结论(1)心肌细胞可以表达IL．17RA，为IL-17潜在的靶细胞。(2)IL．17可上调心肌细胞中MCP．1的表达。(3)IL-17诱导心肌细胞MCP．1表达的作用与IL．17呈浓度时间依赖性。(4)IL．17