aqp4抗体对体外培养大鼠皮层神经细胞的毒性作用

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1、河北医科大学硕士学位论文AQP4抗体对体外培养大鼠皮层神经细胞的毒性作用姓名：刘亚坤申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：任士卿201203中文摘要AQP4抗体对体外培养大鼠皮层神经细胞的毒性作用摘要目的：视神经脊髓炎(NeuromyelitisOptica，NM0)是一种主要侵犯视神经和脊髓的中枢神经系统炎性脱髓鞘性疾病。尽管NMO患者血清中特异性自身抗体即AQP4抗体的发现修改了NMO的诊断标准，且扩展了NMO疾病谱，但仍无确切的证据证明AQP4抗体直接引起NMO。最近研究发现小鼠脑内注射AQP4抗体和人补体可产生类似人NMO的病理改

2、变特征，包括炎性细胞的浸润、神经纤维脱髓鞘、水通道蛋白．4(AQP4)及神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达减少、血管周围免疫球蛋白和补体沉积等。体外研究也表明AQP4抗体阳性的NMO患者血清以补体依赖形式导致原代培养星形胶质细胞坏死，但对大鼠脑皮层混合培养的神经细胞中小胶质细胞和神经元的作用尚未见报道。本研究使用体外培养的胎鼠皮层神经细胞，分别加入AQP4抗体阳性或阴性的NM0患者血清后，观察不同时间点星形胶质细胞、神经元以及小胶质细胞的形态学和数量的变化，以及细胞因子白介素．6浓度的变化，探讨AOP4抗体对皮层神经细胞的毒性作用及其机

3、制。方法：常规方法提取Wistar大鼠胎鼠(孕l6—19天)的大脑i皮层。将皮层神经细胞接种于直径为35mm培养皿中，培养液为含20％J：J台牛血清的DMEM，24h及72h后更换培养液，共培养3天。实验共分为3组：】．正常对照组(control，C)：在37℃C02孵育箱中培养，以10％的比例加入正常人血清。2．AQP4抗体阴性对照组：加入等量AQP4抗体刚性患者血清。3．AQP4抗体阳性组：加入等量AQP4抗体阳性患者血清。培养2h、4h、．6h后分别进行免疫组织化学荧光染色。在倒嚣荧光显微镜(NikonTE2000)下随机选择l0个不同

4、的视野，使用NIS—ElementsBR3．0软件采样，应用ImagePro．Plus软件进行计数MAP一2、GFAP和OX．42阿}生细胞的细胞数，并通过计数Hochest33258标记的细胞核数来明确细胞总数，然后计算卅<同神经细胞所占的比例。结果采用SPSSl3．0统计软件处理，所有计量资料采用页±S表示，多组问单IXJ素方差分析。P<0．05认为差异有统计学意义。中文摘要结果：1．AQP4抗体对原代培养的大鼠皮层神经元及星形胶质细胞形态及数量的影响：结果显示，正常对照组在培养2h、4h、6h后，星形胶质细胞及神经元形态和数量无明显差别

5、，而抗体阳性组和阴性对照组在血清作用2h后即发现星形胶质细胞和神经元形态学的变化，表现为星形胶质细胞胞体肿胀、神经元突起断裂。AQP4抗体阳性组2h时星形胶质细胞和神经元数目分别为33．32±12．25％和46．67+9．48％，和对照组无明显差别(尸>O．05)；4h时星形胶质细胞和神经元数目开始减少，分别为24．73±5．27％和35．49±8．43％(和对照组比较．P均

6、6h比较差异有显著意义(尸均<0．01)。同时我们发现AQP4抗体阴性组4h和6h时神经元数目分别减少为40．89±5．67％和37．40±3．95％，和对照组比较差异有显著意义(尸均<0．01)，而4h时星形胶质细胞数目和对照组无明显差别(分别为29．67±3．40％和30．34±4．53％，P>O．05)，直到6h时才明显减少(25．62±6．85％，和对照组比较尸

7、响：0X42免疫荧光检查显示AQP4抗体阳性血清2h时即出现小胶质细胞胞体增大，边缘不规则，突触变短，随着时间延长，形态学变化更明显。AQP4抗体阳性和阴性组在2h时小胶质细胞数目分别为l8．55±9．78％幂Nl8．39±5．03％，和对照组的15．76±6．66％无明显差别，(P>0．05)，而4h和6h时AOP4抗体阳性组小胶质细胞数目分别增加到27．35±13．17％和40．37±13．28％，抗体阴性组增加到24．70±7．27％31332．60±10．77％，均明显高于对照组(P均

8、数目比较差异无显著意义(尸均>0．05)。3．AQP4抗体对原代培养的大鼠皮层神经细胞分泌IL．6的影响：使用ELISA方法检测不同组别不同时间点细胞培养上清液IL