大鼠大脑皮层星形胶质细胞不同体外培养方法对gfap表达的影响

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1、大鼠大脑皮层星形胶质细胞不同体外培养方法对GFAP表达的影响　　【摘要】目的：比较体外培养纯化星形胶质细胞的不同方法对星形胶质细胞影响，为进一步研究奠定基础。方法：原代培养后分别经振荡纯化、传代纯化的方法培养星形胶质细胞。结果：原代培养的星形胶质细胞纯度不高；经振荡纯化后GFAP表达量明显增多，GFAP免疫荧光变亮；经传代纯化培养后纯度达到97%，GFAP表达量较少。结论：经过传代纯化的星形胶质细胞纯度较高，GFAP表达量较少，因此能更好地反映其在脑中的功能，是研究星形胶质细胞在脑中的功能较好的培养方法。【关键词】星形胶质细胞；体外培养；胶质纤维酸性蛋白【中图分类号】R-311【文

2、献标识码】A【文章编号】1004-7484（2014）06-3494-01【Abstract】Objective：ComparingdifferentwaysofisolationandpurifyastrocytesfrommousecerebraltissuetoLearntheeffectofastrocytesforfuturestudyoftheirfunctionsinthebrain.Methods：Toacquirepurifiedastrocytesbytwousuallyusedculturalmethods：afterprimaryculture，7subcu

3、ltureforthreetimesorshankenovernighttwice.Results：Thepurityofprimaryculturewasthelowest，withthemethodofbeingshankenovernighttwicehighlyexpressedGFAP，Immunofluorescencestainingwithanti-mouseGFAPwasbrighter.Astrocytespurifiedbybeingsubculturedforthreetimesover97%purity.TheexpressionofbyGFAPlow.C

4、onclusion：Withthesubculturalmethodwecanacquirethepurerastrocytesinvitro，whichtheexpressionofbyGFAPlower，andcanbestreflecttheirfunctionsinthebrain.It’sanoptimalmethodtoacquiretheastrocytesforfuturestudyoftheirfunctionsinvivo.【Keywords】astrocyte；invitro；glialfibrillaryacidicprotein7反应性星形胶质细胞及星形胶

5、质细胞与神经元的关系一直以来都是神经科学界关注的热门课题[1]，体外分离纯化星形胶质细胞己有三十余年的历史，为众多研究提供了实验基础，也大大促进了对Ast的特性研究。虽然获取星形胶质细胞的方法较多，但一般研究偏重星形胶质细胞的纯度而较少关注其生物学特性。而不同的体外培养方法可能影响Ast活化，表现为GFAP不同程度的表达，进而可能影响实验结果，本研究将文献常报道的两种方法进行比较，观察不同试验方法对GFAP表达影响，从而获得一种纯度既高，又能满足不同实验要求的星形胶质细胞纯化方法。1材料与方法1.1材料SD乳鼠（泰山医学院实验动物中心）；DMEM/F12粉剂（Gibco产品）；兔抗

6、人GFAP多克隆抗体（北京中杉金桥）；Cy3标记抗兔IgG免疫荧光试剂盒（碧云天生物技术研究所）；细胞核染色剂DAPI（碧云天生物技术研究所）；Image-proplus4.0图像分析系统（IPP公司）。1.2方法1.2.1星形胶质细胞纯化培养选用SPF级、出生时间不超过48h的健康SD乳鼠，75%乙醇浸泡消毒后，处死、取出大脑移入含有预冷的D-Hank’s液培养皿中，洗涤并去除脑膜，夹取少许大脑皮层组织D-Hank’s液中洗涤、剪碎，0.125%胰蛋白酶消化后终止，过滤、离心，弃上清，重新加入培养基，制成单细胞悬液，接种到培养瓶中，差速粘附处理2次。再次制成单细胞悬液，接种至预先

7、用多聚赖氨酸包被过的培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱培养，7～9d后，细胞已80%～90%融合，进行传代培养。1.2.2传代培养时按以下两种方法进行星形胶质细胞培养：（1）培养10～12d，在摇床上以180r/min振荡过夜一次（DMEM基培，37°C，18h），7隔天再以同样的方法振荡第二次，此为“振荡纯化”；以后每4d传一代（不再做震荡纯化），共传三次，每次传代不做差速贴壁，实验取传三代（即第四代）的星形胶质细胞，终密度为1×106/ml左右，于传代后7d进行实