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1、脂多糖对大鼠大脑皮层星形胶质细胞分泌NO的影响：潘月星,金英,隋海娟,张智娟【摘要】目的观察外源性内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用于大鼠大脑皮层星形胶质细胞（astrocyte，AC）时，NO产生和释放的变化，以及选择性诱导型一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase,iNOS)抑制剂S-甲基异硫脲(S-methylisothiourea,SMT)对其的影响。方法运用Griess重氮化反应法检测NO代谢产物NO2-/NO3-来反映正常组、LPS（10μg/mL）诱导后及加入
2、SMT（1μmol/mL）的LPS诱导后NO的活性。结果LPS作用后，AC合成和分泌NO增加，呈时间依赖性，且在24h增加最明显；SMT能明显抑制LPS诱导AC的NO过分泌（P＜0.001）。结论在体外培养的AC，LPS可诱导NO的合成和释放增加，该过程主要是通过激活iNOS表达实现的。【关键词】星形胶质细胞；脂多糖；iNOS；NOAbstract：ObjectiveToexplorethechangeofnitricoxide(NO)byLPSinratastrocytes,andtheeffectofSMTonit.Method
3、sNOethodinnormalastrocytes,LPS(10μg/mL)inducedastrocytes,SMT(1μmol/mL)addedandLPSinducedastrocytes.ResultsNOincreasedinatime-dependentmannerulatethereleaseofNO,arkably.Asaresult，ainmechanismthatcontributestotheaccretionofNOsecretionmightbetheactivationofiNOS.Keyol水平的NO
4、,较cNOS合成的NO浓度高约1000倍［1］。初步研究表明在3种类型NOS中,nNOS和iNOS均与神经损伤机制有关,而eNOS可能有助于防护神经损伤。现已证明，炎症反应在一系列常见神经变性疾病如阿耳茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)，多发性硬化症(multiplesclerosis,MS),帕金森(氏)病(Parkinson’sdisease,PD)，肌萎缩性(脊髓)侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)，亨延顿舞蹈病(Huntington)以及脑缺血和中风(stroke)
5、等发生发展中扮演着重要的角色，甚至成为很多原发病发展的终极［2］。NO在炎症反应中，既是效应分子，又是第二信使和神经递质。而在S，NOS3种亚型均有其特定分布。脂多糖（LPS）是一种以氨基酸为组成单位的磷脂，构成革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要成分，可以作为非特异性免疫刺激物质，引起炎症反应［3］，是研究炎症反应很好的工具。本实验为了探索在LPS所致S炎症反应过程中，AC合成和分泌NO的变化及诱导AC过表达NO可能的主要关键酶类型。1材料1.1实验材料出生24h以内的SD大鼠（辽宁医学院动物实验中心提供），DMEM培养基（Gibco公司）
6、，胎牛血清（华美生物试剂有限公司），多聚赖氨酸、胰蛋白酶（1∶250）、神经胶质酸性蛋白单克隆抗体(glialfibrillaryacidprotein，GFAP)购于Sigama公司，SMT和一氧化氮试剂盒（碧云天生物技术研究所）。1.2细胞培养无菌条件下取出新生1dSD大鼠的全脑,剔除软脑膜和血管，剪碎，加入0.125%的胰酶溶液消化，过滤，离心(1000rpm,10min)，用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，调整细胞密度，以5×105/mL的密度接种于经10μg∕mL多聚赖氨酸处理的75cm2培养瓶中。置于37℃、5
7、%CO2孵箱中培养，以后每3d换液1次，第9天将培养的星形胶质细胞置于恒温摇床上，37℃、260rpm、20h，移去培养基，仍贴壁的细胞大部分为星形胶质细胞，用0.25%胰酶消化后离心，用完全培养其重悬，接种于两个75cm2培养瓶中，以传代。如此，传至两到三代后进行试验。2方法潘月星，等：脂多糖对大鼠大脑皮层星形胶质细胞分泌NO的影响辽宁医学院学报2008年12月，29(6)2.1星形胶质细胞的GFAP染色鉴定间接荧光抗体染色法：将长有细胞的盖玻片经4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3次，10min/次；Triton-100作用3
8、0min，PBS冲洗3次，10min/次；BSA封闭，4℃过夜1∶200兔抗,室温，1h，PBS洗3次，3min/次；1∶200稀释羊抗兔IgG-FITC（Sigma产品），37℃，避光，水浴30min，PBS洗3次，10min/次；
