brg1促进骨髓间充质干细胞定向分化肝细胞

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1、温州医学院硕士学位论文目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2Abstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5第一部分小鼠Brgl慢病毒干扰载体构建及验证．．⋯．．⋯⋯．．6材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．6结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯．⋯．．．．．．⋯⋯⋯11分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．．．．⋯．．．．．．．⋯⋯．⋯．．12第二部分Brgl促进骨髓间充质干细胞向肝细胞分化⋯⋯⋯。14材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯14结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．．．．⋯⋯⋯⋯．．．

2、．18分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯’⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19参考文献⋯．⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．20附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯．．22附表⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．．．⋯⋯⋯．⋯．．28第三部分综述⋯⋯．⋯．．．．．．．．．⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯31附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．38缩写、符号清单、术语表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．39致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．．⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯．40学位论文独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41㈣2川7㈣3Ⅲ哪Ⅲ7，川9洲3㈣2洲Y温州

3、医学院硕士学位论文中文摘要第一部分小鼠Brgl慢病毒干扰载体构建及验证目的构建小鼠Br91(Brahma．relatedgene1)特异性shRNA慢病毒载体并检测其对小鼠骨髓问充质干细胞(BM．MSCs)中Brgl的沉默效应。方法针对小鼠BrglmRNA序列，设计合成3对短发卡RNA(shorthairpinRNA，shRNA)序列，退火形成双链后连入PLL3．7载体；经酶切和测序鉴定后，将重组慢病毒质粒和包装质粒共转染293T细胞，包装得到病毒颗粒并检测其滴度。将病毒液以感染复数(MOI)为5、15和30分别感染BM．MSCs，72h后

4、计算转染效率。将3种病毒液以最佳MOI感染BM．MSCs，同时设未感染病毒的正常对照(Contr01)组和感染空载体病毒的阴性对照(GFP)组，72h后RealtimePCR检测BrglmRNA水平变化，计算抑制效率得出最佳干扰序列。结果双酶切及测序结果证实干扰序列插入正确，MOI为15时对BM．MSCs转染效率最高(90％)，且细胞状态好；与GFP组相比，Br91．shRNA2干扰效率为82．35％，沉默效果最佳(尸<0．01)。结论构建的小鼠Br91．shRNA慢病毒载体能有效降低BM．MSCs中BrglmRNA水平，为进一步研究其在B

5、M．MSCs定向分化肝细胞中的功能奠定了基础。关键词Brgl基因；RNA干扰；骨髓间充质干细胞；慢病毒第二部分Brgl促进骨髓间充质干细胞向肝细胞分化目的了解Brgl在BM．MSCs定向分化肝细胞中的作用。方法全骨髓差异贴壁法分离培养获得P3．P6代BM．MSCs，添加HGF、FGF4培养7d后，RealtimePCR和Westemblot检测Brgl、AFP和Foxa2表达水平，ChIP检测AFP、Foxa2基因启动子区Brgl招募水平，以未诱导Od组为对照。将Brgl慢病毒干扰载体转染BM．MSCs，并设空白对照(Contr01)组和阴

6、性对照(Lv．GFP)组培养24h，换液后添加HGF、FGF4进行培养，7d后检测各组Brgl、AFP和Foxa2表达水平及AFP和Foxa2基因启动子区结合的Brgl水平。结果HGF、FGF4诱导BM．MSCs分化第7d，Brgl、AFP和Foxa2表达明显升高，AFP和Foxa2启动子区招募Brgl水平也明显升高(P

7、化因子AFP和Foxa2的表达。关键词Brgl基因；肝细胞；分化温州医学院硕士学位论文AbstractPart1ConstructionandverificationofmouseBrglgenelentiviralinterferingvectorobjectiveToconstructtheLentiviralvectorexpressingshRNAtargetingmouseBrglandtodetectitssilencingefficiencyofBrglgeneinBM-MSCs．MethodsReferringtothese

8、quenceofBrglmessengerRNA，threepairsofshRNAtargetingmouseBrgl(1，2，3)weresynthesizedandsubc