人关节液对骨髓间充质干细胞定向分化影响的实验研究

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1、目录1人关节液对骨髓间充质干细胞定向分化影响的实验研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1．1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1]02英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．3前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．4材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．5结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯171．6讨论⋯⋯···⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯··⋯⋯⋯⋯·⋯⋯··191．7结j淦·⋯⋯⋯⋯·⋯⋯-⋯·⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯．．·261。8参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯271．9英汉缩略词对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯302附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯·⋯·313致谢··⋯⋯⋯⋯·⋯·⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯····⋯⋯·⋯⋯·⋯⋯·364骨髓间充质干细胞修复关节软骨损伤的研究进展(综述)．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·375攻读学位期问发表的论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49人关节液对骨髓间充质干细胞定向分化影响酶实验研究I愀鼎摘要目的体外获得人骨髓间充质干细胞(humanbonemarrowmesenchymalstemcells，hBMSCs)，

3、并对获取的hBMSCs进行纯化、扩增及鉴定。通过人关节液与hBMSCs混合培养，研究共培养系统导致hBMSCs定向诱导分化的影响，探讨关节液对hBMSCs的作用，为以关节液和BMSCs作为软骨组织工程基质的使用奠定一定的基础。方法从因创伤导致不同部位的骨折需行骨折复位及髂骨植骨术的志愿者中，获取骨髓，采用全骨髓、贴壁培养法培养和分离hBMSCs。在实验过程中，我们还对培养的hBMSCs进行了冻存和复苏。实验在倒置相差显微镜下观察细胞生长形态；取生长状态良好的P3代细胞进行表面标志物的表达和细胞表型的鉴定；取生长状态良好的P1、P2、P3代细胞，分别用胰蛋白酶消

4、化、培养，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制hBMSCs生长曲线图。在无菌操作下，患者取坐位，双膝下垂，穿刺部位按常规进行皮肤消毒，用2％禾1J多卡因作局部麻醉，于健康志愿者的膝关节的髌骨下缘、髌韧带外侧lcm处，定位后用一次性10号注射针头与胫骨平台平行，向内呈45度角i穿刺进入，针头完全刺入即可，抽取膝关节内的关节液，将其与生长良好的P3细胞混合用于实验，将24孔板盲法随机分为3组(A组、B组及C组)，每组8孔，每个孔板内放置无菌并用多聚赖氨酸预处理过的爬片，其中：A组：单纯关节液组(关节液+含体积分数IO％FBS+I％双抗的HG—DMEM)；B组：关节

5、液+hBMSCs组(关节液+hBMSCs+含体积分数IO％FBS+I％双抗的HG-DMEM)；C组：单纯hBMSCs组(hBMSCs+含体积分数IO％FBS+I％双抗的HG—DME6ff)。每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化和生长情况，分别于诱导后第7，14，21天行甲苯胺蓝染色检测酸性糖胺多糖表达，免疫组化染色检测细胞Ⅱ型t胶原表达。结果经全骨髓、贴壁培养法培养分离获得了纯度较高hBMSCs，细胞呈均一的长梭形、短梭形及多角形，漩涡状或辐射状结构，绘制的生长曲线呈s形。所分离培养的细胞表达CD29、CD44、CD90、CDl05分别为：99．6％、100％、

6、99．4％、92．5％，呈均一、高表达性：而表达CD34、CD45分别为：0．5％、0．6％，呈低表达性。hBMSCs与关节液混合培养后，细胞增殖速度减慢，由长梭形变为多角形、椭圆形，细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性阳性，II型胶原免疫组化阳性，表现出向关节软骨细胞分化的特点。结论全骨髓、贴壁培养法可成功分离hBMSCs，该方法具有操作简便、经济及污染少等优点。该实验结果提示，关节液对hBMSCs向软骨细胞分化有正性促进作用，关节液中可能含有促hBMSCs向软骨细胞方向分化的物质，支持关节液作为软骨组织工程基质使用。关键词：关节液骨髓间充质干细胞软骨细胞‘软骨组织工

7、程共培养ResearchoninfluencebonemarrowmesenchymalstemcellsdifferentiationbyjointfluidinvitroAbstract：ObjectionToobtainhumanbonemarrowmesenchymalstemcells，(humanbonemarrowmesenchymalstemcells、hBMSCs)invitro，makingpurification，amplificationandidentificationtheaccessofhBMSCs．Thestudyispropo

8、sedtoexploretheeffe