姜黄素诱导骨髓间充质干细胞分化成肝细胞-论文.pdf

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2014年6月中成药June2014第36卷第6期ChineseTraditionalPatentMedicineVo1．36No．6[21]WuX，DengY．BaxandBH3-domain-onlyproteinsinp53一me—cancerI24cells[J]．FoodChemToxicol，2004，42(10)：diatedapoptosis[J]．FrontBiosci，2002，7(1)：151-156．1543．1552．[22]IkawaS，NakagawaraA，IkawaY．p53familygenes：structural[3O]SriramN，KalayarasanS，AshokkumarP，eta1．Diallylsulfidecomparison，expressionandmutation[J]．CellDeathDiffer，inducesapoptosisinCole320DMhumancoloncancercells：in—1999，6(12)：1154—1161．volvementofcaspase一3，NF—KB，andERK-2[J]．CellBio—[23]WangZ，FukudaS，PelusLM．Survivinregulatesthep53chem，2008，311(1—2)：157—165．tumorsuppressorgenefamily[J]．Oncogene，2004，23(49)：[31]王旭平，赵玲，王容，等．大蒜素对人结肠癌HT298146．8153．细胞增殖影响及作用机制研究[J]中国现代普通外科进[24]OkadaH，BakalC，ShahinianA，eta1．Survivinlossinthymo—展，2007，10(4)：306-309．cytestriggersp53一mediatedgrowtharrestandp53-independent[32]XiaoD，ChoiS，JohnsonDE，eta1．Diallyltrisulfide-inducedcelldeath[J]．ExpMed，2004，199(3)：399-410．apoptosisinhumanprostatecancercellsinvolvesc—JunN—termi-[25]谢洪，张宝泉．Survivin在喉鳞状细胞癌组织中的表达及nalkinaseandextracellular·-signalregulatedkinase-mediated与easpase-3、P53相关性的初步研究[J]．中国现代医学杂phosphorylationofBcl_2[J]．Oncogene，2004，23(33)：5594—志，2007，17(12)：1460-1463．5606．[26]LakhaniSA，MasudA，KuidaK，eta1．Caspases3and7：key[33]KarmakarS，BanikNL，PatelSJ，eta1．Garliccompoundsin—mediatorsofmitochondrlaleventsofapoptosis[J]．Science，ducedcalpainandintrinsiccaspasecascadeforapoptosisinhu—2006，311(5762)：847-851．manmalignantneuroblastomaSH—SY5Ycells[J]．Apoptosis，[27]佘晓玲，冯德云，郑晖，等．Survivin和Caspase．3在肝2007，12(4)：671-684．细胞癌中表达的相关性及其生物学意义[J]．中国现代医[34]ChuYL，HoCT，ChungJG，eta1．Allicininducesp53-me—学杂志，2005，15(18)：2750-2753．diatedautophagyinHepG2humanlivercancercells[J]．JA[28]WangZ．LiuZ．CaoZ．AllicininducesapoptosisinEL_4cellsricFoodChem，2012，60(34)：8363—8371．invitrobyactivationofexpressionofcaspase一3and一12andup—[35]ChaJH．ChoiYJ．ChaSH．eta1．AllicininhibitscellgrowthregulationoftheratioofBax／Bcl-2[J]．NatProdRes，2011，andinducesapoptosisinU87MGhumanglioblastomacells26(11)：1033·1037．throLIghanERK-dependentpathway[J]．OncolRep，2012，28[29]LuHF，SueCC，YuCS，eta1．Diallyldisulfide(DADS)in—(1)：41_48．ducedapoptosisundergocaspase-3activityinhumanbladder姜黄素诱导骨髓间充质干细胞分化成肝细胞陈艳，邹文静，王盛丰，乔洪翔(1．浙江工业大学药学院，浙江杭州310014；2．浙江康恩贝制药股份有限公司，浙江杭州310052)摘要：目的研究姜黄素诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的作用。方法贴壁筛选法体外培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测其表面抗原。分组诱导培养14d：1组(空白对照组)，2组(10ng／mL成纤维细胞生长因子一4，FGF-4)，3组(10ng／mLFGF-4+20ng／mL肝细胞生长因子，HGF)，4组(10ng／mLFGF-4+5ixmol／L姜黄素)，5组(20p~mol／L姜黄素)。观察细胞形态学改变；利用western—blotting分析肝特异性蛋白HNF一3p的表达。结果大鼠骨髓间充质干细胞细胞表面抗原CD34、CD14、CD45阴性表达，CIM4、CD73、CD90表达阳性；药物诱导后光镜下观察到骨髓问充质干细胞细胞由梭形渐变成圆形肝细胞；诱导分化后的细胞表达肝特异性蛋白HNF一3p。结论姜黄素具有促进骨髓问充质干细胞分化为肝细胞的作用。关键词：分化；肝细胞；大鼠骨髓间充质干细胞；姜黄素中图分类号：R285．5文献标志码：A文章编号：1001—1528(2014)06—1124-05doi：10．3969／i．issn．1001—1528．2014．06．003收稿日期：2013-04-12基金项目：浙江省自然科学基金资助(Y2111178)；浙江省科技厅重大专项基金资助(2010C13015)作者简介：陈艳(1977一)，女，博士，副教授，研究方向：中药药理。Tel：15888851620，E-mail：chenyan2008@zjut．edu．cn1124 2014年6月中成药June2014第36卷第6期ChineseTraditionalPatentMedicineVo1．36No．6CurcumininducesthedifferentiationofbonemarrowmesenchymalstemcellsintohepatocytesCHENYan，ZOUWen．jin，WANGShen．feng，QIAOHong．xiang(J．CollegeofPharmaceuticalScience，ZhejiangUniversityofTechnology，Hangzhou310014，China；2．ZhejiangConbaPharmaceuticalCo．，d．Hangzhou310052，China)ABSTRACT：AIMToinvestigatewhethercurcumincaninducedifferentiationofratbonemesenchymalstemcells(rBMSCs)intohepatocytesvitro．MWTHoDSrBMSCswereisolatedfromadultSDrats，andthenwereculturedandclonedbydensitygradientmethodandadhesivecultivation．Theircellsurfaceantigensweredetectedwithflowcytometer．rBMSCsobtainedwererandomlyassignedtofivegroups：group1(contro1)，group2(in-ducedby10ng／mLFGF-4)，group3(inducedby10ng／mLFGF-4combinedwith5p~mol／Lcurcumin)，group4(inducedby10ng／mLFGF-4combinedwith20ng／mLHGF)，andgroup5(inducedby20~xmol／Lcurcu—min)．Afterinduction，hepatocytescellpercentagewasdetermined，andtheexpressionofspecificproteinsofHNF．3Bwasanalyzed．RESULTSCD44，CD73andCD90expressionofrBMSCswaspositivewhilethatofCD34．CD14andCD45wasnegative．indicatingthesuccessfulcultureofrBMSCs．Afterinductionwithcurcu—min，rBMSCsshowedmorphologicalvariation．TheexpressionlevelsofHNF一3Bingroup2，3，and4weresignifi—cantlyhigherthanthoseinthegroup1．CoNCLUSIoNCurcumincaninducerBMSCstodifferentiateintohepa-tocytescellsinvitro．KEYWORDS：differentiation；hepatocytes；rBMSCs；curcumin姜黄CurcumalongaL．是一种常用的中药，1材料具有活血、化瘀、行气、通经、止痛等功效J，1．1药物与试剂胎牛血清(Hyclone)，DMEM而姜黄素(curcumin)是从姜黄的根茎中提取的一高、低糖培养基(Gibco)；PerPC标记抗大鼠种二苯基庚烃类成分(如图1所示)，含有量约占CD14、CD44、CD34、CD90、CD73、CD45(Santa姜黄的3％～5％[21。研究证明J，姜黄素能有效Cruz)；PE标记抗小鼠IgG(Katara)；PerPC标记促进大鼠骨髓间充质干细胞(ratbonemesenchymal抗小鼠IgG(SantaCruz)；FITC标记抗小鼠IgGstemcells，rBMSCs)早期成骨分化，且能抑制肝星(SantaCruz)；胰岛素(江苏万邦生化医药股份有状细胞(HSC)增殖、诱导HSC凋亡，使胶原合限)；转化生长因子61(RB)；ITS+(Sigma)；成减少，减轻肝纤维化大鼠肝内胶原的沉积，从多地塞米松(Sigma)；FGF-4(peprotech)；HGF方面抑制肝纤维化的发生、发展。为了进一步(peprotech)；山羊抗大鼠HNF．3B一抗(Santa了解姜黄素诱导rBMSCs分化的特点，本实验以姜cruz)；兔抗山羊IgG二抗(Santacruz)；兔抗大鼠黄素为研究对象，以分化为指标，观察其对大鼠问B-actin一抗(Santacruz)；羊抗兔IgG二抗(博士充质干细胞分化为类肝细胞的影响。德)姜黄素标准品购自中国药品生物制品检定所，编号，07372200173。1．2仪器流式细胞仪(BDBiosciences)；CO细胞培养箱(Galaxy)；Nikon光学倒置显微镜H(Nikon)；电泳仪(Tanon)；日立高速离心机CR21G(日立工机株式会社)；紫外分光光度计IRixR2OCH3IIRlOCH3R2HUV2550(日本岛津株式会社)。II1R1R2。二H1．3动物4～6周龄雄性清{吉级SD大鼠3只，图1姜黄素化学结构体质量100～120g，购于浙江省医学科学院，许可Fig．1Chemicalstructureofcurcumin证SCxK(浙)2008-0233。1125 2014年6月中成药June2014第36卷第6期ChineseTraditiona1PatentMedicineVol_36No．62实验方法10ng／mLFGF-4+5~mol／L姜黄素诱导48h后，2．1rBMSCs的分离与培养脱颈法处死大鼠，更换DMEM低糖培养基；4组(双细胞因子组)：取出股骨和胫骨置装有D—Hanks液的烧杯中；用含10ng／mLFGF-4+20ng／mLHGF诱导48h后，更血清培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，换DMEM低糖培养基；5组(姜黄素组)200目筛网过滤，1500#min离心3min后混悬细20~mol／L姜黄素诱导48h后，更换DMEM低糖培胞，接种到培养皿中，置于CO：培养箱中培养；养基；每3d换液一次，诱导14d后对分化细胞进接种后第24小时和第48小时全量换液，后每3d行鉴定。全量换液一次，至细胞70％～80％融合时，进行2．4细胞形态学观察每日于倒置显微镜下观察传代培养。细胞分化前后的形态学改变。2．2流式细胞术检查rBMSCs表面抗原将生长2．5Westernblotting法测定肝特异性蛋白HNF-3~状态良好的第三代细胞按1x10个／管的密度平均的表达细胞诱导14d后，将蛋白裂解液加入收集分到1．5mL离心管中，1000r／min离心5min后，到的细胞中；每隔5min剧烈震荡1rain，重复6次，弃去上清，加入D—Hanks液100重悬细胞；分再将样品4℃12000r／min离心30min。吸取上清别向各管细胞中加入PerPC标记抗大鼠CD14、细胞蛋白溶液，采用CoomassieBrilliantBlue法进行FITC标记抗大鼠CD34、FITC标记抗大鼠CIM4、蛋白定量，将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合PE标记抗大鼠CD90、PE标记抗大鼠CD73、PE后加loadingbuffer后上样。将蛋白样品在15％的标记抗大鼠CD45、FITC标记抗小鼠IgG、PE标记SDS．PAGE凝胶中电泳约3h，然后转印至PVDF膜抗小鼠IgG、PerPC标记抗小鼠IgG，以及D．Hanks上，5％脱脂奶粉封闭2h后，加入HNF．3B一抗液(阴性对照管)，常温避光45min，用D．Hanks(1：1000)过夜。TrBS洗3次后加入辣根过氧化液洗细胞3次后，进行流式细胞术检测，以判断物酶标记的二抗(1：1ooo)作用30min，ECL法显rBMSCs的均一度。色、x光胶片显影定影后分析处理。2．3姜黄素诱导rBMSCs分化为肝细胞的实验3结果将生长状态良好的第三代细胞细胞悬液以2×103．1流式细胞仪检测结果流式结果显示，分离细胞／mL接种于6孔板中；待细胞完全融合生长培养得到的细胞能高表达rBMSCs的表面抗原时，弃去培养基，分成5组进行诱导分化，1组CD44、CD73以及CD90，但不能够表达造血系细(空白对照组)：仅更换DMEM低糖培养基；2组胞的表面抗原CD14、CD34以及CD45，表明我们(单细胞因子组)：10ng／mLFGF-4诱导48h后，分离培养获得较为均一的rBMSCs。具体流式结果更换DMEM低糖培养基；3组(联合诱导组)：见图2所示。图2rBMSCs表面抗原表达情况Fi昏2AnalysisphenotypeoftherBMSCsbyflowcytometry 2014年6月中成药June2014第36卷第6期ChineseTraditionalPatentMedicineVo1．36No．6Res，2009，154(3)：122—132．参考文献[9]LeeKD，KuoTK，Whang—PengJ，eta1．Invitrohepaticdif-赵秀玲．姜黄的化学成分、药理作用及其资源开发的研究ferentiationofhumanmesenchymalstemcells[J]．Hepatology，进展[J]．中国调味品，2012，37(5)：9-13．2004，40(6)：1275-1284．[2]涂永元，徐先祥，邱飞．姜黄素前药的研究进展[J]．[1O]OhSH，MiyazakiM，KouchiH，eta1．Hepatocytegrowth有机化学，2012，32(5)：852-859．factorinducesdifferentiationofaduhratbonema~owcellsintoa[3]顾巧丽，蔡燕，黄晨，等．姜黄素调控大鼠骨髓间充hepatocytelineageinvitro[J]．BiochemBiophysResCommun，质干细胞的成骨分化[J]．中国组织工程研究，2012，162000，279(2)：500-504．(27)：5057-5061．Schwa~zRE，ReyesM，KoodieL，eta1．Muhipotentadult[4]李志强，曹文富．姜黄素防治肝纤维化作用机制的研究进progenitorcellsfrombonema~owdifferentiateintofunctional展[J]．重庆医学，2012，41(1O)：1024—1026．hepatocyte-likecells[J]．ClinInvest，2002，109(10)：[5]陆伦根，胡俊杰．肝纤维化研究进展[J]．肝脏，2012，171291—1302．(9)：617-620．[12]TrusolinoL．ComoglioPM．Scatter-factorandsemaphorinre—[6]AyatollahiM，SoleimaniM，TabeiSZ，eta1．Hepatogenicceptors：cellsignallingforinvasivegrowth[J]．NatRevCane—diferentiationofmesenchymalstemcellsinducedbyinsulinlikeer，2002，2(4)：289-300．growthfactor-I[J]．％JStemCells，2011，3(12)：[13]HillanKJ，LoganMC，FerrierRK，eta1．Hepatocyteprolif-113—121．erationandseiumhepatocytegrowthfactorlevelsinpatientswith[7]龚圆渊，张力华．中药对骨髓间充质干细胞多向分化影响alcoholichepatitis[J]．JHepatol，1996，24(4)：385—390．的研究进展[J]．河南中医，2012，32(2)：252-254．[14]KinoshitaT，MiyajimaA．Cytokineregulationofliverdevelop—[8]ChivuM，DimaSO，StancuCI，eta1．Invitrohepaticdif-ment[J]．BiochimBiophysActa，2002，1592(3)：303—312．ferentiationofhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsun—[15]SilviaC．Liver—enrichedtranscriptionfactorsandhepatocytedif-derdifferentialexposuretoliver-specificfactorsJ1．Translferentiation[J]．FASEBJ，1996，10(2)：267-282．龟鹿二仙胶对铅鼠海马CA。区长时程增强损伤的修复作用吴传云，阮迪云，董昌武，吴云龙，周雪梅，王建青(1．安徽中医药大学中医临床学院，安徽合肥230038；2．中国科技大学生命科学院，安徽合肥230027)摘要：目的探讨龟鹿二仙胶对发育期铅暴露大鼠海马CA．区突触可塑性的影响。方法在出生当天将仔鼠随机分为正常组、正常+龟鹿二仙胶组、铅组及铅+龟鹿二仙胶组。仔鼠出生后饮用0．2％的醋酸铅溶液，建立铅鼠模型，采用石墨炉原子吸收光谱法测血铅，用液态等离子质谱法测定海马铅水平，在位电生理记录海马CA区的场电位。结果和正常组相比，铅鼠血铅、海马铅水平明显升高，长时程增强(LTP)的幅度显著下降，均有显著性差异(P<0．01)；而同期铅+龟鹿二仙胶组海马铅水平比铅组显著下降(P<0．01)，其P幅度明显高于铅组大鼠(P<0．05)。结论龟鹿二仙胶对发育期慢性铅暴露大鼠LTP幅度的下降有修复作用。关键词：铅；龟鹿二仙胶；长时程增强中图分类号：R285．5文献标志码：A文章编号：1001—1528(2014)06—1128-05doi：10．3969／j．issn．1001—1528．2014．06．004GuiluErxianGelrescuesthelead·-inducedimpairmentoflong-termpotentiationinhippocampalCA1regionoftherats收稿日期：2013—12—12基金项目：973计划重大项目(2012CB5250003)；安徽中医药大学自然科学研究基金面上项目(2012zr015)作者简介：吴传云(1970一)，女，博士，讲师，从事神经药理与毒理、脏腑证候学基础及病证演变规律、中医诊断学教学和理论研究。Tel：15955167035，E-mail：chyw@mail．ustc．edu．en通信作者：阮迪云(1945一)，男，教授，博士生导师，从事神经药理与毒理研究。E-mail：ruandy@ustc．edu1128