人源线粒体蛋白frataxin与铁作用机制的研究

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1、论文答辩日期：’▲}f?■∽＼．4674一献一文一结考谢述小参致综f～／峙温州医学院硕士学位论文英文缩写英文缩写词表英文全称中文全称bpDNAEColiEB‘EDTAIPTGkDanmOOPBSPCRpHrpmBasepairdeoxyribonucleicacidEscherichiacoliethidiumbromideethylenediaminetetraaceticacid碱基对脱氧核糖核酸大肠杆菌溴乙锭乙二胺四乙酸Isopropy—B—D—thiogalactoside异丙基硫代一B—D一半孚L糖kil

2、odaltonnanometeropticaldensityphosphate——bufferedsalinepolymerasechainreactionpowerofhydrogenrevolutionsperminuteSDS—PAGEsodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectropheresis千道尔顿纳米光密度磷酸盐缓冲液聚合酶链反应酸碱度每分钟转速十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳TEMEDTetramethylethylenediamine四甲基乙二胺2Nr帝◆

3、●‘&吁l～■'口温州医学院硕士学位论文氨基酸缩写勺0温州医学院硕士学位论文人源线粒体蛋白frataxin与铁作用机制的研究中文摘要目的：’构建含frataxin基因的原核表达载体，分离纯化有活性的frataxin蛋白和hIscA，探索氧化压力对frataxin与铁作用效果的影响，为进一步研究体内frataxin转运铁的机制奠定基础。方法：1．含frataxin基因的原核表达载体的构建采用PCR方法，以pET26b(+)一F)(N为模板，扩增FXN基因，并将其克隆入原核表达载体pET28b(+)，测序鉴定质粒构建是

4、否正确，将其转入E．∞．!工BL21中，IPTG诱导其表达，SDS-PAGE电泳分析表达产物。2．表达上清中frataxin与hIscA的纯化与apo—FXN与apo-hIseA的制备表达的N端带His标签的frataxin和hiscA蛋向，通过镍柱亲和层析的方法纯化，SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析表达产物，对hIscA特征峰扫描。纯化后的frataxin与hIscA蛋白溶液中加入10ram的EDTA在37℃孵育30分钟。再经过脱盐桩纯化，得到脱铁后的蛋白，脱铁效果用菲咯嗪分光光度法鉴定和全波长扫描。3．Fra

5、taxin活性的检测(1)测定frataxin的铁结合活性，首先将纯化的apo-F)(N，DTT与不同浓度的FeE+和柠檬酸混合，以加和不加H202作为对比，在37℃孵育30分钟。然后用G-25脱盐柱重新纯化反应后的frataxin。frataxin结合的铁含量用茚咯嗪分光光度法测定。(2)Frataxin对质粒DNA的抗氧化损伤的保护作用，提取pBR322质粒，电泳鉴定其结构状态完好，这些质粒DNA将与不同浓度的Frataxin和Fe2+、H202混合，37℃孵育30分钟，通过琼脂糖电泳来分析DNA氧化损伤情况。

6、(3)frataxin抑制铁诱导自由基的产生，将不同浓度的frataxin与DTT，Fe2+，2一脱氧核糖在37℃孵育lO分钟，然后加入0．5mM的过氧化氢继续反应25分钟，之后取600ul反应液与400ul含1％的硫代巴比士酸和2．8％的三氯乙酸的显色液混合，煮沸15min，14000rpm离心15min取上清用DU-800在532硼检测其吸光度，以不加铁的作为空白对照。4吣‘，●温州医学院硕士学位论文结果：1．原核表达载体的构建测序结果表明原核表达载体pET28b(+)一F删与设计一至，工程菌E．coliBL2

7、1／pET28b(+)一F烈在适当的条件下诱导表达后，经SDS-PAGE电泳鉴定在19KD处产生一个特异的条带。工程菌E．coliBL21／pET28b(+)一hIscA在适当的条件下诱导表达后，经SDS-PAGE电泳鉴定在16KD处产生一个特异的条带，对其仝波长扫描证明表达载体构建正确。。2．表达上清中frataxin与hIscA的纯化与Apo—FXN与Apo-hIscA的制备frataxin与hIscA蛋白经过镍柱亲和层析和G_25脱盐柱脱盐后，通过电泳鉴定，其纯度均在95％以上，frataxin能被抗His-

8、tag小鼠单克隆抗体识别。脱铁后的frataxin与hlscA用菲咯嗪分光光度法检测，几乎不含有任何铁，即得到Apo-FXN与Apo-hlscA。3．Frataxin活性的检测(1)检测结果表明frataxin在没有过氧化氢的条件下，几乎不结合铁，加入过氧化氢后，frataxin与铁结合活性明显增强，并随着加入的铁的浓度升高而增加。(2)电泳图显示过氧化氢与