人血清白蛋白与配体相互作用的结构机制研究

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1、国密锻：f进童监奎撼星蜜缓：垒五监奎丕基量》博士学位论文作者姓名：王主指导教师：董卿塞班宜虽簋±生昱短生雷整掌赫揖基塑匮缝擅班宜匮学位类别：璺坐簋±学科专业：生塑也鳖l臼!生物堂研宄所：生雷整堂陆煎建塑厘结衄宜匮2013年5月．StructuralmechanismonInteractionofligandsw——ith．HumanSerumAlbuminBy【YuWang】ADissertation／ThesisSubmittedtoTheUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForth

2、edegreeofDoctorofBiochemistryandMolecularBiologyFujianInstituteofResearchontheStructureofMatterMay,2013致谢本文是在黄明东老师精心指导和大力支持下完成的。黄明东老师以其严谨求实的治学态度、对科学研究敏锐的洞察力和对高度的敬业精神、兢兢业业、孜孜以求的工作作风我产生重要影响。他渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维给了我深深的启迪。在攻读博士期间，黄明东老师不仅在学业上给我以精心指导，同时他还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此黄明东老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。本论文在实验和写作过程中，也得

3、到许多其它方面的帮助。特别感谢石小莉老师对我实验以及文章写作的指导，她为我完成这篇论文提供了巨大的帮助。感谢袁彩老师在学位论文修改时候的指导。还要感谢陈卓老师、陈明晃老师在试验过程给予宝贵的意见和建议，感谢叶晓明老师在实验仪器使用和耗材提供上的后勤保障，感谢江龙光、陈锦灿、周山勇老师对我工作上和生活上无私关心帮助，感谢罗智璞博士在蛋白质解析给予的帮助。感谢实验室的林忠辉、赵宝玉、李林森、张旭、徐苋、李謇、洪泽斌、胡萍、龚立虎、陈松和刘敏等共同营造的温馨和睦环境，为我攻读博士阶段留下许多美好回忆。我要感谢我的父母和家人，焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回报，你们永远健康快乐是我最大的心愿!我要

4、向百忙之中抽时间对本文进行审阅的各位老师表示衷心的感谢。最后，再次对关心、帮助我的老师、同学和亲朋好友表示衷心地感谢。王字二。一三年五月摘要瓤(1)葡萄糖能在生理条件下以非酶学的形式与蛋自发生反应，在高血糖的糖尿病病人身上，这种糖基化更为严重，并且引起多种并发症。人血清白蛋白(HSA)是血浆中最为丰富的蛋白之一，并且其会被葡萄糖所糖基化。我们测定了重组人血清白蛋白：葡萄糖和人血清白蛋白：果糖两种复合物晶体结构。我们发现这两种晶体结构中都存在线性结构和环形结构的单糖分子。其中，线性的葡萄糖分子与Lysl95形成共价键，但是环状葡萄糖分子却没有发生上述反应。基于这些结构，我们提出了人血清白蛋白上的

5、Lysl95和Lysl99共同参与葡萄糖开环的结构机制。这些结论有助于我们理解葡萄糖开环过程和蛋白被单糖糖基化的分子机制。(2)II一(dansylamino)undecanoicacid(DAUDA)是一种丹磺酰类的荧光探针，被广泛应用于测定人血清白蛋白结合位点。我们解析了rHSA：Myr：DAUDA三元复合物的晶体结构，并观察到两个DAUDA分子分别结合在人血清白蛋白6，7位的鹰肪酸结合位点上，并且这两个结合位点是人血清白蛋白结合脂肪酸较弱的结合位点。这一结构表明DAUDA分子是人血清白蛋白6，7位脂肪酸结合位点上的探针，而非文献报道的1位脂肪酸(胆红素结合位点)结合位点上的探针。(3)溶

6、血磷脂(1ysoPLs)是细麒的代谢物，参与多种重要生理病理的过程。溶血磷脂酰胆碱(LPC)是溶血磷脂中的一种重要的成分。在生理过程中，LPC主要以结合态的形式存在，其中包括结合人血清白蛋白。这种结合可能用来调节LPC的活性，比如减少LPC引起的细胞毒性。目前，LPC如何结合人血清白蛋白的相关机制并不清晰。在本研究中，我们通过荧光淬灭法和光干涉计量法两种实验方法发现LPC能够与人血清白蛋白结合，并测量得到它们之间的解离常数约为25IIM。我们还测定了在14碳的脂肪酸存在或者不存在的情况下，人血清白蛋白与LPC的复合物晶体结构。在rHSA：LPC二元复合物晶体结构中，6个LPC分子分别结合在人血

7、清白蛋白I人血清白蛋白与配体相互作用的结构机制研究脂肪酸结合位点上。rHSA：Myr：LPC三元复合物结构表明在脂肪酸存在的情况下，LPC仍然会结合在人血清白蛋白1，3，5位脂肪酸结合位点上。此项研究明确了人血清白蛋白可以作为溶血磷脂运输载体的观点，并且提出溶血磷脂结合人血清白蛋白的结构机制。关键词：人血清白蛋白，结构生物学，葡萄糖，荧光探针，脂肪酸结合位点，溶血磷脂，溶血磷脂酰胆碱Abstrac