以线粒体dld蛋白为靶点研究重金属对leydig细胞的毒性作用分子机制

《以线粒体dld蛋白为靶点研究重金属对leydig细胞的毒性作用分子机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：以线粒体DLD蛋白为靶点研究重金属对Leydig细胞的毒性作用分子机制CytotoxicMechanismRelatedtoDihydrolipoamideDehydrogenaseinLeydigCellsExposedtoHeavyMetals作者姓名：纪洵敏指导教师姓名：黄亚东及学位、职称：博士研究员学科、专业名称：理学微生物与生化药学专业论文提交日期：2015年6月论文答辩日期：2015年6月3号答辩委员会主席：杜军教授（中山大学）论文评阅人：盲审学位授予单位和日期：暨南大学2015年6月30号摘要目的:以线粒体蛋白

2、二氢硫辛酰胺脱氢酶（Dihydrolipoamidedehydrogenase，DLD）为靶点，研究重金属（铅、镉和锰）对睾丸间质细胞（Leydig细胞）的毒性作用，阐明其毒理机制，为重金属污染导致的男性性功能低下的治疗提供实验依据。方法:采用灌胃的方式给予成年雄性SD大鼠铅暴露（10mg/kg和25mg/kg），给药时间为10W；采用灌胃的方式给予成年雄性SD大鼠镉暴露（5mg/kg和25mg/kg），给药时间为7W；采用腹腔注射的方式给予成年雄性SD大鼠锰暴露（5mg/kg和10mg/kg），给药时间为7W。给药结束后，留取血液和睾丸组织进行检测。选用重金属

3、铅（100μmol/L和500μmol/L）、镉（10μmol/L和20μmol/L）、锰（500μmol/L和1000μmol/L）作用于Leydig细胞株R2C细胞，并添加25μM的22-羟基胆固醇作为底物，24h后收取培养上清和细胞。采用放射免疫法检测血清中睾酮和培养上清中孕酮的含量；通过Westernblotting的方法分别检测类固醇激素合成酶的表达和cAMP-PKA/PKC-ERK1/2通路蛋白的表达及其磷酸化水平；应用流式细胞仪技术和免疫荧光技术检测Leydig细胞的线粒体膜电位。为了验证重金属对DLD的下调作用，通过免疫组化和Westernblo

4、tting的方法检测细胞和睾丸组织中DLD蛋白的表达。利用siRNA干扰技术，选用最佳干扰条件沉默R2C细胞中DLD的表达，用放射性免疫技术检测细胞培养上清中孕酮的含量，应用流式细胞仪技术检测线粒体膜电位，采用Westernblotting法检测类固醇激素合成酶的表达和cAMP-PKA/PKC-ERK1/2通路相关蛋白的表达及其磷酸化水平，由此证实DLD与重金属抑制类固醇激素分泌毒性作用机制的相关性。结果:体内外实验结果显示，重金属能抑制Leydig细胞合成类固醇激素，下调类固醇激素合成关键酶StAR、CYP11A1和3β-HSD的蛋白表达，使细胞线粒体膜电位下

5、降，同时显著下调PKA、PKC的蛋白表达和ERK1/2蛋白的磷酸化水平。不同重金属暴露后，Leydig细胞中DLD蛋白的表达水平明显下调。siRNA干扰技术I沉默DLD表达后，R2C细胞的类固醇激素合成水平明显下降；线粒体膜电位没有变化；类固醇激素合成关键酶StAR和3β-HSD的蛋白表达也出现明显的下调趋势。更重要的是，由于DLD的表达沉默，cAMP-PKA-ERK1/2信号通路中，细胞内cAMP水平显著下降，PKA的表达下调，ERK1/2的磷酸化水平也同步下调。结论：重金属暴露能显著抑制DLD蛋白的表达，通过抑制cAMP/PKA-ERK1/2信号通路的活化和

6、类固醇激素合成关键酶StAR、CYP11A1和3β-HSD的表达，最终抑制类固醇激素的合成。通过siRNA干扰技术沉默DLD表达后，类固醇激素合成关键酶StAR和3β-HSD的蛋白表达也出现明显的下调，类固醇激素合成信号通路cAMP-PKA-ERK1/2的活化也受到抑制，最终同样导致了类固醇激素合成的下降。也就是说，在Leydig细胞中，DLD一方面可以作为cAMP上游的信号分子，调控cAMP/PKA-ERK1/2信号通路的活化，另一方面可以调控合成酶StAR和3β-HSD的蛋白表达来调节类固醇激素的合成；而重金属下调DLD蛋白的表达使其抑制类固醇激素合成，以及

7、对Leydig细胞产生毒性效应的重要靶点。关键词：重金属，睾丸间质细胞，二氢硫辛酰胺脱氢酶，类固醇激素IIABSTRACTObjective:Tostudythecytotoxicmechanismrelatedtodihydrolipoamidedehydrogenase(DLD),amitochondrialprotein,inLeydigcellsexposedtoheavymetals.Method:Invivo，theratsweredividedintodifferentgroups:PbtreatmentratsweretreatedwithPbb

8、ygavageindos