线粒体相关蛋白调控突触核蛋白病理学作用研究

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1、单位代码１０４７５学号１０４７５３１２０９６５分类号Ｑ１８９—Ａ呼為乂聲硕±学位论文线粒体相关蛋白调控突触核蛋白病理学作用研究＇学科、专业：神经生物学研究方向：神经退行性疾病基础研究申请学位类别：理学硕±申请人：李平指导教师：魏建设教授二〇—五年五月关于学位论文独创声明和学术诚信承诺本人向河南大学提出巧去学位申请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的对所研究的课题有新的见解。据我所知除文中特别加Ｗ说明、标注和致谢的地方外，，，论文中不达括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括其他人为获

2、得任倚教育、科研机构的学位或证书而使用过的材科一。与我同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在此本人部重承诺：所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为文责自负。，学位申请人（学位论文作者）签名：科２〇日ｌＪ年＾月ｆ名关于学位论文著作权使用授权书本人经河南大学审核批准授予硕去学位。作为学位论文的作者人完全了解并同意河南大学，本、、數据收集杭构和有关保留、使巧学位论文的要求科研信忠机构，即河南大学有权向国家图书馆本校图书馆等提供学位论文（纸质文本和电子文本）Ｗ供公众检、查阅。本人授权河南大学出索于宣扬、览校术发展和行术交流

3、目的可Ｗ取影印、缩、担描和贝复制手段保展学学进学等，采印拷等存、汇编位论文（纸文本和电子文本）。学质（涉硬保密容的学位论文在解密后适用本授权书）内位获得者（位论文者）签名：学学作＾曰２０１ｙＪ年月若／位论文指城学■ａ２０１月年ｒｊｆｊTheroleofmitochondria-associatedproteinsinregulatingsynucleinopathiesADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequire

4、mentsfortheDegreeofMasterofScienceByPingLiSupervisor:Prof.JiansheWeiMay,2015摘要PINK1是一种线粒体丝氨酸/苏氨酸激酶，保护细胞压力应激所导致的线粒体功能障碍，调控神经元分化。突变的PINK1(PARK6)导致常染色体隐性遗传早发性帕金森病(PD)。β-synuclein(β-syn)是α-syn同系物，其错义突变β-synP123H被发现存在于家族性路易体痴呆患者。突变蛋白β-synP123H在细胞内形成嗜酸性包涵体，并且与LAMP-2，ATP13A2，cathepsin等溶酶体标志物共存，在胞浆聚集诱导细胞凋

5、亡，具有加速神经退化的毒性作用。PINK1能够维持线粒体内稳态，在PD病理学变化过程起着关键作用，但是PINK1通过线粒体保护作用介导突触核蛋白病理学过程的机制还不清楚。本课题将在稳定表达Parkin的HeLa细胞及稳定表达β-synP123H的B103神经母细胞瘤细胞进行，研究PINK1/Parkin通过调控线粒体自噬，促进β-synP123H自噬降解的神经保护作用及其分子机制。本文采用PCR构建PINK1野生型(PINK1WT)及两步PCR法定点突变技术构建PINK1Q126P、E240K、G309D、L347P、P498L突变真核表达载体，测序验证后应用免疫印迹技术(WesternB

6、lot)鉴定其在细胞内表达情况。WST-1细胞活性检测及LDH细胞毒性实验分析PINK1WT及突变体对细胞存活的影响。结果显示，转染PINK1突变体的细胞存活率下降，细胞毒性增加。相比对照组，转染野生型PINK1质粒的细胞无显著性差异。应用细胞免疫荧光化学染色的方法，观察PINK1WT及其突变体细胞定位情况，以及Parkin突变体T240R、R275W的细胞分布形态。运用线粒体TMRE荧光标记技术，以FCCP组作为阳性对照，分析Parkin突变体T240R、R275W对线粒体膜电位的影响。通过脂质体转染及WesternBlot方法，分析PINK1、Parkin对线粒体分裂融合动态变化的影响

7、。免疫荧光细胞化学结果显示：PINK1突变后线粒体异常聚集。Parkin突变体在胞浆形成聚集体，并且导致线粒体膜电位降低。免疫印迹分析结果显示：PINK1、Parkin的突变则导致了线粒体分裂、融合功能降低。野生型PINK1、Parkin参与线粒体质量控制，促进β-synP123H自噬降解。免疫荧光细胞化学实验证明β-synP123H及ParkinT240R聚集体经自噬溶酶体途径降解，ParkinT240R则加重了β-s