葡萄糖调节蛋白75在a53t突变α-突触核蛋白致帕金森病线粒体损伤中的作用及机制研究

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1、复旦大学硕士学位论文葡萄糖调节蛋白75在A53T突变a-突触核蛋白致帕金森病线粒体损伤中的作用及机制研究院系:华山医院专业:神经病学姓刘丰稻指导教师:王坚教授导师组成员：丁正同副教授邬剑军副教授完成日期:2011年4月8日录中文摘要1Abstract4英文缩略语7引W8参考文献10第一部分A53T突变a-突触核蛋白对SH-SY5Y细胞的影响12MS12材料和方法13实验结果24#^30参考文献32小胃34第二部分葡萄糖调节蛋白75表达水平的调控及相应细胞系的构建35前W35材料和

2、方法36实验结果42Hi45参考文献46第三部分葡萄糖调节蛋白75对A53T突变a-突触核蛋白所致线粒体障碍的影11?47Wg47材料和方法49实验结果51if56参考文献58小胃60综述：a-突触核蛋白所致线粒体异常与帕金森病61参考文献65在读期间发表或待发表文章68敌m69中文摘要葡萄糖调节蛋白75在A53T突变ct-突触核蛋白致帕金森病线粒体损伤中的作用及机制研究a-突触核蛋白是帕金森病相关基因PARK1/4的编码产物，也是帕金森病病理标志路易小体的主要组成部分，探讨a

3、-突触核蛋白的具体作用机制对研究散发性帕金森病和家族遗传性帕金森病都具有重要价值。尽管a-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的关键作用已经被研究多年，目前已知其可能通过异常聚集的寡聚体损害细胞内的生物膜系统，但其确切的致病机制仍然未明。研究显示，a-突触核蛋白异常聚集与帕金森病发病机制中的另外一个核心环节“线粒体损伤”互相关联，可作用于线粒体引起线粒体功能障碍和融合/分裂异常，因而研究a-突触核蛋白对线粒体的作用具有重要意义。葡萄糖调节蛋白75是热休克蛋白70家族的重要成员，主要定位于线粒体，被认为与帕金森病相关；

4、也有研究称葡萄糖调节蛋白75与a-突触核蛋白存在相互作用，但就其具体作用机制未见报道。我们通过高表达致病性更强的A53T突变a-突触核蛋白、调控葡萄糖调节蛋白75的表达来研究葡萄糖调节蛋白75在A53T突变a-突触核蛋白所致线粒体损伤的作用及可能的机制。第一部分A53T突变a-突触核蛋白对SH-SY5Y细胞的影响目的探讨高表达A53T突变a-突触核蛋白对SH-SY5Y细胞的影响。方法通过脂质体转染A53T突变a-突触核蛋白构建稳定高表达A53T突变a-突触核蛋白的SH-SY5Y细胞系。在该细胞系的基础上，通过C

5、CK-8法检测细胞在线粒体毒物鱼藤酮作用下的细胞活力变化，通过检测乳酸脱氢酶（LactateDehydrogenase,LDH)释放量反映鱼藤酮对细胞的损伤程度，以探讨高表达A53T突变a-突触核蛋白对多巴胺能细胞鱼藤酮敏感性的影响。通过免疫印迹检测高表达A53T突变a-突触核蛋白后细胞葡萄糖调节蛋白75的变化。通过检测线粒体膜电位、Bax/Bcl2表达量比值、细胞浆细胞色素C释放量等反映细胞线粒体功能损害。通过检测线粒体Drpl(dynamin-relatedprotein1)和Mfn2(mitofusin-

6、2)表达量来探讨A53T突变a-突触核蛋白影响线粒体融合/分裂的可能机制。结果A53T突变a-突触核蛋白可以加剧SH-SY5Y细胞对线粒体毒物鱼藤酮的敏感性，使鱼藤酮作用下细胞活力显著下降（P〈0.01)，明显增加LDH的释放复旦大学硕士学位论文(p〈0.01)。同时，高表达A53T突变a-突触核蛋白后，主要定位于线粒体的葡萄糖调节蛋白75的表达量显著下降（p<0.01)。A53T突变a-突触核蛋白可以降低线粒体膜电位，使Bax/Bcl2的表达比值显著升高，但并未增加细胞浆中细胞色素C的释放。我们证实A53T突

7、变a-突触核蛋白对线粒体融合/分裂的影响并没有通过线粒体动力学相关蛋白Drpl和Mfn2。结论高表达A53T突变a-突触核蛋白能损伤SH-SY5Y细胞，该损伤作用可能是通过线粒体损伤介导实现的。第二部分葡萄糖调节蛋白75表达水平的调控及相应细胞系的构建目的调控葡萄糖调节蛋白75在细胞内的表达水平。方法根据葡萄糖调节蛋白75的基因序列设计葡萄糖调节蛋白75的干扰序列。之后在慢病毒表达质粒上加入葡萄糖调节蛋白75序列和干扰序列，利用慢病毒包装系统，成功包装并浓缩获得高浓度慢病毒颗粒。借助慢病毒转染靶细胞，经分离纯化

8、及免疫印迹鉴定后获得能调控葡萄糖调节蛋白75表达量的稳定细胞系。结果我们成功设计了葡萄糖调节蛋白75的干扰序列，能将葡萄搪调节蛋白75的表达量下调50%以上。之后成功包装并浓缩了调控葡萄糖调节蛋白75的慢病毒颗粒，葡萄糖调节蛋白75高表达慢病毒的滴度为：lX107Tu/mL，葡萄糖调节蛋白75下调慢病毒的滴度为：3X107Tu/mL。利用慢病毒我们分离获得了能高表达葡萄糖调节蛋白75和