帕金森病相关蛋白parkin在β-synuclein p123h突触核蛋白病理变化过程中的作用研究

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1、TheroleofParldnson’sdisease—associatedproteinParkinonsvnucleinoDathiesinducedbvB．SvnucleinP123HSVnUCleln0DatnleSlnnUCenDVD-3VnUCIelnrlZjHADissertationSubmittedtotheGraduateSch001ofHenanUniVersityinP抓ialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceBy耽馏MSupervisor：Prof．

2、WreiJiansheMay，2014关于学位论文舭脚和学术诚信承诺l燃㈣缈本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在此本人郑重承诺：所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为，文责自负。学位申请人(学位论文作者)签名：2014年占月7日关于学位

3、论文著作权使用授权书本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者，本人完全了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文(纸质文本和电子文本)以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校学术发展和进行学术交流等目的，可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复制手段保存、汇编学位论文(纸质文本和电子文本)。(涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书)叮易山学位获得者(学位论文作者)签名：羔熟20l学位论文指导教师签名：201缸年与月／7日摘要P破in(PA鼬Q)

4、与常染色体隐性遗传的家族性帕金森病相关，P删n蛋白分子量为52l(D，主要分布在细胞质中，是一种E3泛素连接酶，可以保护对细胞毒性的各种应激，并且在帕金森病的保护中起重要作用。p．synPl23H突变体能够在细胞中形成溶酶体样包涵体，从而导致自噬性细胞退化。国内外对P蒯n介导的线粒体自噬有诸多报道，但是对于P删n在p．synPl23H诱导的突触核蛋白病理变化过程中对蛋白的降解、细胞的白噬和存活所起到的作用和机制并不清楚。这项研究中，我们探讨P破in及其突变体在p．syIlPl23H诱导的突触核蛋白病理变化过程中的作用，有助于澄清帕金森病突触核蛋白病理变化

5、过程的发病机制，为帕金森病的治疗和预防提供新的理论依据。本实验首先通过PCR构建带有HA标签的Parkin野生型(ParkinWT)和两步PCR构建带有HA标签的Parkjn突变体R42P、T240R、I也75w、C441R的真核表达质粒，通过双酶切和测序确定序列的正确性，通过WestemBlot的方法确定质粒能够在真核细胞上表达；通过细胞爬片和免疫荧光技术了解野生型和突变型P破in在细胞内的分布特征；通过wST-1和LDH的测定来了解和分析野生型和突变型的P破in本身对于细胞的存活的影响以及对细胞产生的毒性。发现野生型P删n弥散分布于细胞胞浆内，而突变

6、型P破in在细胞的胞浆内细胞核周围呈小颗粒状的包涵体存在，P破in突变体具有细胞毒性。其次，构建并筛选出稳定表达Parkin野生型和突变型R42P、T240R、R275W、C441R的Hela细胞株，在稳定表达P破in的细胞株上，运用免疫荧光双标记的方法，研究P删n及其突变体对线粒体的影响。我们发现突变型P玳in导致线粒体的聚集和片段化，FCCP处理细胞导致线粒体去极化，ParkjnwT能够被募集到去极化的线粒体上，但是Parkin突变体丧失了这一功能。最后，在稳定表达P溅n野生型和突变型T240R的Hela细胞株上，瞬时转染pCEP4，p-syn野生型

7、(D—synwT)和p—synPl23H，分别通过Parkin和p-syn，Parkin和LC3以及p-syn和p62的免疫荧光双标记实验，LC3和p．syn的westemBlot实验，研究ParkjnwT和ParkinT240R对自噬和p-syIlPl23H的作用，发现ParkinWT能够促进p-syIlPl23H通过自噬溶酶体途径降解，减缓p．synPl23H在细胞内的累积，起到保护细胞的作用，P破in突变体的作用与P删nWT的作用相反。在稳定表达D．syIlPl23H的293T细胞上瞬时转染pTI迮2hyg、Pad【in野生型和四种突变体后，检测A

8、t95、Beclin-l的水平和mTOR通路上的mTOR、p70S6K、4E．B