lps刺激对单核细胞mirna表达谱的影响

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1、LPS刺激对单核细胞miRNA表达谱的影响LPS刺激对单核细胞miRNA表达谱的影响专业名称：重症医学学位申请人：周仁祥导师：熊旭明教授中文摘要背景脓毒症（sepsis）是由感染所导致的全身炎症反应综合征，是机体对外源性致病微生物如细菌、真菌、病毒等进行免疫应答过程中所出现的失控的炎症反应并最终可能导致多器官功能障碍。脓毒症发病率高，大多病情危重，加之治疗技术手段有限，因而成为现代危重病医学所面临的一个重大挑战。病原体入侵机体后可被机体的抗原提呈分子识别，继而与炎症细胞结合，启动炎症反应，促进炎症介质释放。失衡的炎症细胞活化及炎症因子释放，

2、通过影响血流动力学、凝血及细胞凋亡等机制进一步损害各脏器的功能。目前脓毒症尚缺乏特效分子靶向治疗，以使用抗生素、强化液体管理及实施支持治疗为主导的治疗策略并未能显著降低脓毒症患者的病死率，尽管2002年巴塞罗那宣言上提出通过集束化管理等措施在5年内减少25%脓毒症患者病死率的远景目标，但最终只减少了近6.2%的病死率。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性非编码RNA,由21~25个核苷酸组成，通过形成miRNA核蛋白体复合物（miRNPs）与靶标mRNA的碱基完全或部分配对，从而产生抑制或降解作用，调控目的基因的表达。研究

3、表明，miRNA可在脓毒症信号通路、炎症介质产生、细胞凋亡及器官功能障碍等多个3广州医科大学硕士学位论文病理生理过程起调控作用，参与炎症反应的细胞部分miRNA的表达变化明显，可进入血液循环，成为潜在的脓毒症分子标志物。单核细胞系在脓毒症早期炎症反应过程中发挥主导性的作用，而脂多糖是革兰阴性菌细胞壁的重要组分，也是目前研究最为透彻的病原相关分子模式，可通过刺激单核细胞诱发脓毒症早期炎症反应。研究单核细胞在脓毒症发生后miRNA表达谱的变化，有助于进一步明确脓毒症的发病机制，阻断脓毒症的疾病进程。目的1.研究THP-1细胞在LPS刺激下其mi

4、RNA表达谱的变化。2.为进一步研究miRNA对炎症反应的调控作用提供参考，并寻找可能的诊断性能优越的脓毒症分子标志物。内容与方法1.培养实验用THP-1细胞并传代，冻存及复苏实验用细胞。2.分别以0ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/mlLPS刺激THP-1细胞，在刺激后6小时、12小时、24小时及48小时收集细胞上清液，应用ELISA法检测不同LPS刺激浓度、不同刺激时长的细胞上清液内的IL-6水平，探索适宜的炎症刺激条件。3.实验组以1000ng/mlLPS刺激THP-1细胞，对照组只添加R

5、PMI-1640，每组各4个培养孔，48小时后分离培养液及细胞。ELISA法对培养液内的IL-6水平进行测定，对细胞的炎症反应进行验证。4.采用PBS洗液洗涤实验组与对照组离心后分离得到的细胞，通过Trizo法提取总RNA并将其转移入2mlEP管内，空白对照组4管标记1、2、3、4，实验组4管标记5、6、7、8，进行妥善的封装后放置于-80℃冰箱内。5.委托博奥生物有限公司进行AgilentmiRNAmicroarray芯片检测，采用AgilentFetureExtraction(v10.7)、AgilentGeneSpring、GeneS

6、pring等软件进行数据处理及统计分析。4LPS刺激对单核细胞miRNA表达谱的影响结果1.不同浓度LPS刺激THP1细胞在不同的时间段细胞所释放的IL-6水平不同，刺激浓度越大，IL-6水平越高（P<0.05）。2.从对数折线图上可以看出，THP-1细胞IL-6分泌呈现出高度时间依赖性，刺激24小时以后IL-6水平显著升高。3.实验组与对照组相比，部分miRNA出现显著改变，实验组hsa-miR-21-5P、hsa-miR-146a-5P及hsa-miR-29b-3p等部分miRNA出现显著上调，hsa-miR-16-5P、hsa-miR

7、-92a-3P、hsa-let-7a-5P等部分miRNA表达出现显著-4-7下调（所有P值均在10～10之间）。结论1.内毒素脂多糖（LPS）能诱导THP-1细胞释放IL-6；2.LPS刺激浓度越大，THP-1细胞分泌的IL-6水平越高，IL-6在LPS刺激24小时后才出现显著地上调；3.受LPS刺激的THP-1细胞miRNA表达谱出现变化，部分miRNA出现显著上调或下调。关键词：脂多糖；脓毒症；单核细胞；微小RNA；5广州医科大学硕士学位论文ThevariationofmiRNAsexpressedbymonocytewiththes

8、timulationbylipopolysaccharideSepsisisanillnesscharacterizedbysystemicinflammatoryrespons