资源描述：
《声波刺激对拟南芥基因表达的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、2005年11月重庆大学学报(自然科学版)Nov.2005第28卷第11期JournalofChongqingUniversity(NɑturɑlScienceEdition)Vol.28No.11:1000-582X(2005)11-0138-043声波刺激对拟南芥基因表达的影响王伯初,张 进,段传人,王道红(重庆大学生物工程学院生物力学与组织工程教育部重点实验室,重庆 400030):运用银染mRNA逆转录差异显示(DDRT-PCR)技术,初步研究了声波刺激对拟南芥差异基因表达的影响.研究分离得到SA3、SG2-1、SG2-2、SG7-1、SG7-2、CA2共6个差异表达基
2、因片段,进一步运用Northern点杂交确定SA3、CA2、SG7-1为阳性片段,其中SA3片段属于声波刺激特异表达基因,SG7-1片段属于声波刺激增强表达基因,CA2片段属于声波刺激抑制表达基因.研究结果表明植物在基因水平对声波刺激具有响应,为下一步探索植物响应声波应力的分子生物学调控机理奠定了基础.:声波刺激;拟南芥;差异显示
:Q68:A[1] 由Liang等于1992年首次建立的mRNA差异组中加入1.26μgRNA样品,然后加入锚定引物,锚显示聚合酶链式反应技术(mRNAdifferentialdisplay定引物和样品的总体积达到11μL,不足11μL时加
3、PCR,DD-PCR)是目前在筛选、克隆差异表达基因方入DEPC处理水补足.于70℃育温混合物5min,在冰上面广为应用的技术.该方法通常采用测序胶放射自显冷却,加入:4μL,5×逆转录缓冲液;2μL,10mmol/L4×影来显示扩增条带,虽然有敏感性高的优点,但是易造dNTP;20mmol/(min·L),RNase抑制剂;加DEPC水成放射性同位素污染,且实验周期长,对实验条件要求定容至19μL.在37℃育温5min,加1μL,2.0×[2]52也较高.银染方法的建立,始于1979年对蛋白质的10mol/(min·L)的MMuLV逆转录酶,混合后在[3]染色,以后逐渐应用于核酸.在笔者
4、的研究中,采用42℃育温60min,加热至70℃并维持10min停止反银染mRNA差示显示分析了声波刺激后的拟南芥,并应,然后于冰上冷却.获得了3个阳性片段.1.2.3PCR在PCR扩增中所选用的锚定引物和逆转录中的1 材料与方法锚定引物相同,随机引物设计为:HAP1,AAGCTTGAT21.1材料TGCC;HAP2,AAGCTTCGACTGT;HAP3,AAGCTTT2将拟南芥分为声波刺激组和对照组,声波刺激的GGTCGA;HAP4,AAGCTTCTCAACG;HAP5,AAGCT2声强为100dB,频率为1000Hz.对刺激组刺激9d,每TAGTAGGC;HAP6,AAGCTTCGAC
5、CAT;HAP7,天刺激60min,实验组接受刺激时,对照组也拿出培养AAGCTTAACGAGG;HAP8,AAGCTTTTACCGC.箱,放置在与实验组条件一致的环境中.按照每个锚定引物和8个随机引物配对,每个样1.2方法品用3个锚定引物,则共有24个引物对.在PCR扩增1.2.1总RNA的提取中所选用的锚定引物和逆转录中的锚定引物相同.采用RNeasyPlantMini试剂盒提取刺激组和对照1.2.4电泳组的总RNA.采用Bio-Rad的电泳槽和电泳仪,进行6%变性1.2.2逆转录丙烯酰胺凝胶电泳.取3.5μLPCR产物与2μL甲酰在本次实验中,根据文献[4]合成3种锚定引物,胺上样缓
6、冲液混合,置80℃孵育2min,将样品加入oligo-d(T)10M(M=G,A,C).在每管刺激组和对照6%变性聚丙烯酰胺凝胶上,恒定电压45V电泳约3:2005-07-08:国家自然科学基金资助项目(30470431) :王伯初(1962-),男,江苏宜兴人,重庆大学教授,博士,从事植物生物力学工程和生物制药工程研究.第28卷第11期 王伯初,等:声波刺激对拟南芥基因表达的影响1393.5～4h.加样前先将凝胶加样孔中的尿素用加样器2.2银染结果冲干净,以利于得到高分辨率的差异显示cDNA片段.电泳完毕后,用银染法检测不同材料基因转录水1.2.5
7、银染平上的差异,根据差异片段的大小和重复性结果笔者[5][6]参考Carlos和Brant的方法对硝酸银染色方选取了6条条带,结果见图2.片段SA3的大小为法进行改进.银染步骤:1)固定,加入100mL固定溶270bp,片段CA2的大小为370bp,片段SG2-1的大液(10%乙醇,1%醋酸),轻轻摇动10min.2)漂洗,用小为300bp,片段SG2-2的大小为190bp,片段蒸馏水洗胶1min.3)预处理,用100m
