声波刺激对拟南芥基因表达的影h向

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1、2005年11月重庆大学学报(自然科学版)NOV．20O5第28卷第11期JournalofChongqingUniversity(NaturalScienceEdition)V01．28No．11文章编号：1000—582X(2005)11—0138—04声波刺激对拟南芥基因表达的影H向王伯初，张进，段传人，王道红(重庆大学生物工程学院生物力学与组织工程教育部重点实验室，重庆400030)摘要：运用银染mRNA逆转录差异显示(DDRT—PCR)技术，初步研究了声波刺激对拟南芥差异基因表达的影响．研究分离得到SA3、SG2—1、SG2

2、—2、SG7—1、SG7—2、CA2共6个差异表达基因片段，进一步运用Northern点杂交确定SA3、CA2、SG7—1为阳性片段，其中SA3片段属于声波刺激特异表达基因，SG7—1片段属于声波刺激增强表达基因，CA2片段属于声波刺激抑制表达基因．研究结果表明植物在基因水平对声波刺激具有响应，为下一步探索植物响应声波应力的分子生物学调控机理奠定了基础．关键词：声波刺激；拟南芥；差异显示中图分类号：Q68文献标识码：A由Liang等¨于1992年首次建立的mRNA差异组中加入1．26gRNA样品，然后加入锚定引物，锚显示聚合酶链式反应

3、技术(mRNAdifferentialdisplay定引物和样品的总体积达到l1，不足l1L时加PCR，DD—PCR)是目前在筛选、克隆差异表达基因方入DEPC处理水补足．于70℃育温混合物5min，在冰上面广为应用的技术．该方法通常采用测序胶放射自显冷却，加入：4，5×逆转录缓冲液；2，10mmol／L4×影来显示扩增条带，虽然有敏感性高的优点，但是易造dNTP；20mmol／(rain·L)，RNase抑制剂；加DEPC水成放射性同位素污染，且实验周期长，对实验条件要求定容至19L．在37oC育温5rain，加1L，2．0×也较高

4、j．银染方法的建立，始于1979年对蛋白质的10mol／(min·)的MMuLV逆转录酶，混合后在染色【3j，以后逐渐应用于核酸．在笔者的研究中，采用42℃育温60rain，加热至7O℃并维持10rain停止反银染mRNA差示显示分析了声波刺激后的拟南芥，并应，然后于冰上冷却．获得了3个阳性片段．1．2．3PCR在PCR扩增中所选用的锚定引物和逆转录中的1材料与方法锚定引物相同，随机引物设计为：HAP1，AAGCTFGAT-1．1材料11GCC；HAP2，AAGCTTCGACT(；HAP3，AA(TIT—将拟南芥分为声波刺激组和对照组

5、，声波刺激的GGTCGA；HAP4，AAGCTI'CTCAACG；HAP5，AAGCT_声强为100dB，频率为1000Hz．对刺激组刺激9d，每TAGTAGGC；HAP6，AAGCTrCGACCAT；HAP'／，天刺激60rain，实验组接受刺激时，对照组也拿出培养AAGCTI'AACGAGG；HAP8．AAGCTITrACCGC．箱，放置在与实验组条件一致的环境中．按照每个锚定引物和8个随机引物配对，每个样1．2方法品用3个锚定引物，则共有24个引物对．在PCR扩增1．2．1总RNA的提取中所选用的锚定引物和逆转录中的锚定引物相同

6、．采用RNeasyPlantMini试剂盒提取刺激组和对照1．2．4电泳组的总RNA．采用Bio—Rad的电泳槽和电泳仪，进行6％变性1．2．2逆转录丙烯酰胺凝胶电泳．取3．5IxLPCR产物与2甲酰在本次实验中，根据文献[4]合成3种锚定引物，胺上样缓冲液混合，置8O℃孵育2rain，将样品加入oligo—d(T)10M(M=G，A，C)．在每管刺激组和对照6％变性聚丙烯酰胺凝胶上，恒定电压45V电泳约·收稿日期：2005—07—08基金项目：国家自然科学基金资助项目(30470431)作者简介：王伯初(1962一)，男，江苏宜兴人

7、，重庆大学教授，博士，从事植物生物力学工程和生物制药工程研究．第28卷第l1期王伯初，等：声波刺激对拟南芥基因表达的影响1393．5—4h．加样前先将凝胶加样孔中的尿素用加样器2．2银染结果冲干净，以利于得到高分辨率的差异显示eDNA片段．电泳完毕后，用银染法检测不同材料基因转录水1．2．5银染平上的差异，根据差异片段的大小和重复性结果笔者参考Carlos和Brant的方法对硝酸银染色方选取了6条条带，结果见图2．片段SA3的大小为法进行改进．银染步骤：1)固定，加人100mL固定溶270bp，片段CA2的大小为370bp，片段SG2

8、—1的大液(10％乙醇，1％醋酸)，轻轻摇动10min．2)漂洗，用小为300bp，片段SG2—2的大小为190bp，片段蒸馏水洗胶1rain．3)预处理，用100mL1．5％的硝酸SG7—1的大小为580bp，片段SG