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1、2005年11月重庆大学学报(自然科学版)NOV.20O5第28卷第11期JournalofChongqingUniversity(NaturalScienceEdition)V01.28No.11文章编号:1000—582X(2005)11—0138—04声波刺激对拟南芥基因表达的影H向王伯初,张进,段传人,王道红(重庆大学生物工程学院生物力学与组织工程教育部重点实验室,重庆400030)摘要:运用银染mRNA逆转录差异显示(DDRT—PCR)技术,初步研究了声波刺激对拟南芥差异基因表达的影响.研究分离得到SA3、SG2—1、SG2
2、—2、SG7—1、SG7—2、CA2共6个差异表达基因片段,进一步运用Northern点杂交确定SA3、CA2、SG7—1为阳性片段,其中SA3片段属于声波刺激特异表达基因,SG7—1片段属于声波刺激增强表达基因,CA2片段属于声波刺激抑制表达基因.研究结果表明植物在基因水平对声波刺激具有响应,为下一步探索植物响应声波应力的分子生物学调控机理奠定了基础.关键词:声波刺激;拟南芥;差异显示中图分类号:Q68文献标识码:A由Liang等¨于1992年首次建立的mRNA差异组中加入1.26gRNA样品,然后加入锚定引物,锚显示聚合酶链式反应
3、技术(mRNAdifferentialdisplay定引物和样品的总体积达到l1,不足l1L时加PCR,DD—PCR)是目前在筛选、克隆差异表达基因方入DEPC处理水补足.于70℃育温混合物5min,在冰上面广为应用的技术.该方法通常采用测序胶放射自显冷却,加入:4,5×逆转录缓冲液;2,10mmol/L4×影来显示扩增条带,虽然有敏感性高的优点,但是易造dNTP;20mmol/(rain·L),RNase抑制剂;加DEPC水成放射性同位素污染,且实验周期长,对实验条件要求定容至19L.在37oC育温5rain,加1L,2.0×也较高
4、j.银染方法的建立,始于1979年对蛋白质的10mol/(min·)的MMuLV逆转录酶,混合后在染色【3j,以后逐渐应用于核酸.在笔者的研究中,采用42℃育温60rain,加热至7O℃并维持10rain停止反银染mRNA差示显示分析了声波刺激后的拟南芥,并应,然后于冰上冷却.获得了3个阳性片段.1.2.3PCR在PCR扩增中所选用的锚定引物和逆转录中的1材料与方法锚定引物相同,随机引物设计为:HAP1,AAGCTFGAT-1.1材料11GCC;HAP2,AAGCTTCGACT(;HAP3,AA(TIT—将拟南芥分为声波刺激组和对照组
5、,声波刺激的GGTCGA;HAP4,AAGCTI'CTCAACG;HAP5,AAGCT_声强为100dB,频率为1000Hz.对刺激组刺激9d,每TAGTAGGC;HAP6,AAGCTrCGACCAT;HAP'/,天刺激60rain,实验组接受刺激时,对照组也拿出培养AAGCTI'AACGAGG;HAP8.AAGCTITrACCGC.箱,放置在与实验组条件一致的环境中.按照每个锚定引物和8个随机引物配对,每个样1.2方法品用3个锚定引物,则共有24个引物对.在PCR扩增1.2.1总RNA的提取中所选用的锚定引物和逆转录中的锚定引物相同
6、.采用RNeasyPlantMini试剂盒提取刺激组和对照1.2.4电泳组的总RNA.采用Bio—Rad的电泳槽和电泳仪,进行6%变性1.2.2逆转录丙烯酰胺凝胶电泳.取3.5IxLPCR产物与2甲酰在本次实验中,根据文献[4]合成3种锚定引物,胺上样缓冲液混合,置8O℃孵育2rain,将样品加入oligo—d(T)10M(M=G,A,C).在每管刺激组和对照6%变性聚丙烯酰胺凝胶上,恒定电压45V电泳约·收稿日期:2005—07—08基金项目:国家自然科学基金资助项目(30470431)作者简介:王伯初(1962一),男,江苏宜兴人
7、,重庆大学教授,博士,从事植物生物力学工程和生物制药工程研究.第28卷第l1期王伯初,等:声波刺激对拟南芥基因表达的影响1393.5—4h.加样前先将凝胶加样孔中的尿素用加样器2.2银染结果冲干净,以利于得到高分辨率的差异显示eDNA片段.电泳完毕后,用银染法检测不同材料基因转录水1.2.5银染平上的差异,根据差异片段的大小和重复性结果笔者参考Carlos和Brant的方法对硝酸银染色方选取了6条条带,结果见图2.片段SA3的大小为法进行改进.银染步骤:1)固定,加人100mL固定溶270bp,片段CA2的大小为370bp,片段SG2
8、—1的大液(10%乙醇,1%醋酸),轻轻摇动10min.2)漂洗,用小为300bp,片段SG2—2的大小为190bp,片段蒸馏水洗胶1rain.3)预处理,用100mL1.5%的硝酸SG7—1的大小为580bp,片段SG
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