利用rnai技术对拟南芥液泡h

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1、摘要植物液泡I-I+-ATPasc(V-ATPasc)是一类特殊的膜转运结合蛋白，能水解ATP产生能量、调节PH值、产生跨膜质子电化学势梯度来驱动物质转运；同时，在植物处于逆境时还能通过调节自身的活性使植物适应环境得以生存，作为胁迫响应酶受到越来越多的关注。拟南芥V-ATPasc由13个亚基组成，其中c亚基对逆境的响应更为敏感。本论文利用RNAi技术获得了拟南芥4个P'H．4-c基因不同沉默程度的纯合体转基因植‘物，并对其中的两个基因功能进行了初步分析，结果如下：1．构建了拟南芥VHA-cl叫基因共7个RNAi表达载体，通过农杆菌介导法将其分别导入野生型拟南芥，并成功获得了针对其

2、中4个基因的纯合转基因拟南芥。2．用半定量RT-PCR对3个基因的纯合转基因植物中目标基因的沉默水平进行了检测，其中：VH,,I-cI得到了7株纯合转基因植株，有2株沉默程度较强：VHA．．c4得到了10株纯合转基因植株，4株沉默程度较强：V]-IA-c5得到了18株纯合转基因植株，有5株中等程度沉默个体。表明基因沉默载体的构建是有效的。3．用半定量RT-PCR对目标基因的沉默特异性的检测发现：对VI-L4-cl的沉默是特异的，而对VHA-c4的沉默同时引起了同源性较高的VHA-c2的沉默。4．对VHA-cl沉默纯合体植株的表型分析发现：光照下，RNA干扰导致沉默纯合体的根和下胚

3、轴变短。其中c1。4．1下胚轴平均比对照短21％，c1．16-5下胚轴平均比对照短29％；cll4一l根长平均比对照短9％，c1．16-5根长平均比对照短29*,4；暗培养5天后测量，发现4个株系I／HA-cl沉默纯合体的根和下胚轴的伸长量也均小于对照，表明V-ATPase在细胞扩展中起用。5．盐胁迫下，FHA．-c4和c2共沉默纯合体的根长均短于对照，表明l'rHyt-c4和c2基因对拟南芥V-ATPase在抗盐胁迫反应中的作用是必不可少的。关键词：拟南芥；V二朋甲a∞：VH．A'C亚基；RNAi；转基因；光；盐胁迫PrimaryStudyontheFunctionofSubu

4、nitCGenesofVacuolar矿一ATPaseinArabidopsisthalianabyRNAihbstractTheplantvacuolarH+-ATPase(V-ATPase)isamembrane-boundtransporterprotein,itusestheenergyreleasedduringcleavageofthe7-phosphateofcytosolicATP,therebycreatinganelectrochemicalrr-gradientwhichisthedrivingforceforavarietyoftransportevent

5、sofmetabolites．Understressconditions，theplantcanadjustactivityof'theV-ATPaseandbecomemoreadaptivetoenvironment．Hence，theV-ATPasewasnamedthestress-respondingenzyme．V-ATPaseofArabidopsiscontains13distinctsubunits，andsubunitcisthemostsensitivecomponentwhenplantsarcsubjectedtostressconditions．Int

6、hisdissertation,primaryfunctionofsome删一cgeneswasanalyzedbyRNAiandtheresultsshowed：1．Totally7RNAico咖tstargetingdifferentregiomofthe5VHA-cgenesweremadeandwel'etransferredintowild-typeArabidopsis，andhomozygoustransgenicplantsfrom4outofthe5geneswereobtained．2．Thetargetgeneexpressionlevelinthehomo

7、zygoustransgenicplantswasdetectedbysemi-quantitativeRT-PCR．AllthethreeV／-魏-cgenescheckedshoweddifferentlevelsilencing，indicatingthattheRNAiconstructionsareeffective．Forexample，weobtained7VHA-cltransgenichomozygoteand2linesshowedstrongdecrease