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时间:2019-01-09
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1、非生物胁迫对拟南芥IQM4基因表达的影响 【摘要】本文首先以拟南芥IQM4基因为搜索对象,检索了两个生物信息数据库,搜索到IQM4基因对几种非生物胁迫均能产生应答,并对IQM4基因表达量进行了分析;然后参考数据库所提供的实验方法,采用半定量RT-RCR技术验证了几种非生物胁迫对IQM4基因表达的影响。结果表明盐和渗透胁迫均能抑制幼苗期IQM4基因表达,而脱水、低温和机械损伤早期能增强IQM4基因表达水平。实验初步证明拟南芥IQM4基因在植物非生物胁迫中发挥重要作用。 【关键词】拟南芥;IQM4;非生物胁迫;基因表达 在植物信号转导途径中,Ca2
2、+作为动植物细胞内重要的第二信使,通过Ca2+传感蛋白及其靶蛋白来调节多种生化和细胞反应。钙调素(Calmodulin,CaM)是目前最重要的一类胞内Ca2+信号受体。在众多的CaMs中,除CaM7具有转录调控活性外,其它均无任何酶活性,必需与其下游的靶蛋白―钙调素结合蛋白(calmodulin-bindingprotein,CaMBP)来调节细胞生理功能[1]。 植物中有5个含IQ基序的钙调素结合蛋白家族:IQM、Myosin、CNGC、IQD和CAMTA,其中IQM家族由我们发现[2]。拟南芥IQM家族共有6个成员,均含1个IQ基序,N-端具有
3、与豌豆重金属诱导蛋白6A的同源序列,C-端具有与天花粉素的同源序列。IQM1编码1个Ca2+不依赖型的CaMBP,影响保卫细胞内活性氧(reactiveoxygen6species,ROS)水平,在气孔运动中发挥重要作用,IQM1缺失抑制了光诱导的气孔张开,iqm1突变体表现气孔开度小和根较短的表型[3];IQM1过表达株系则表现为气孔开度大和根较长[4]。IQM4(编号为At2g26190)是IQM家族中与IQM1高度同源的成员[5],其功能未见报道。为了研究IQM4的基因功能,本文以IQM4基因为搜索对象,检索了两个生物资源信息数据库,搜索到IQ
4、M4基因对几种非生物胁迫均能产生应答;为了验证生物信息数据库中IQM4基因表达的数据,本文开展了盐、甘露醇、脱水、低温以及损伤处理对IQM4基因表达影响的分析,该研究结果为进一步开展IQM4基因的功能研究提供重要理论依据。 1实验材料 实验所用的拟南芥(Arabidopsisthaliana)为Columbia(Col)生态型。MS盐购自Sigma公司,PrimeScriptOneStepRT-PCRKit,RNAisoPlus购自TaKaRa公司,NaCl和Manntiol试剂购于上海生工。 2实验方法 2.1拟南芥培养 土壤培养:将经过
5、4℃浸泡3d的吸涨种子直接点种于营养土表面,置于长日照培养室中培养(温度为22±2℃,光周期为16h光照/8h黑暗,光照强度为100μmol?m-2?s-1,相对湿度为85%,下同)。 1/2MS培养基培养:取经过4℃浸泡3d的吸涨种子,用75%乙醇浸泡5~10s后弃乙醇,再加入0.1%HgCl2浸泡5min后弃HgCl2,用无菌水漂洗3~4次。最后加入适量的0.3%Agar溶液悬浮,接种到1/2MS培养基上,置于长日照培养室中培养。6 2.2生物信息学数据库的检索 以IQM4基因为搜索对象,检索AtGenExpressVisualizatio
6、nTool(http://jsp.weigelworld.or)和GenevestigatorExpressionData(https://www.genevestigator.com),以基因表达改变量为1.5倍为阈值,筛选对IQM4基因表达影响较大的非生物因素作为后续实验的依据。 2.3非生物胁迫的处理 渗透胁迫处理:将1/2MS固体培养基上生长2周的幼苗小心拔出,需保持幼苗的根的完整性,称取30~50mg幼苗为一个样品,共称取6个样品;将样品浸没于300mmol/L甘露醇溶液中,分别在0.5、1、3、6、12和24h取样。 盐胁迫处理:称
7、取6个2周幼苗样品,将样品浸没于150mmol/L氯化钠溶液中,分别在0.5、1、3、6、12和24h取样。 低温处理:称取3个2周幼苗样品;将样品置于4℃处理,分别在0.5、1和3h取样。 脱水处理:称取3个2周幼苗样品;将样品放在滤纸上,并置于长日照培养室中,分别在0.5、1和3h取样。 损伤处理:先用带有锯齿的镊子夹伤生长在培养基上的2周幼苗,然后置于长日照培养室中,分别在0.25和0.3h取样。 2.4IQM4基因的RT-PCR分析 参照RNAisoPlus说明书提取非生物胁迫处理的样品总RNA。 以IQM4编码序列的特异引物F1
8、:5’-AGTTAGCTCTTCAGCATTGGC-3′和R1:5’-TCTTCTTGTTCCTCTGTAA
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