拟南芥atwnk9基因定位和表达研究

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1、拟南芥AtWNK9基因定位和表达研究基金项目：国家自然科学基金资助项目(31171176)；湖南省自然科学基金资助项目(11JJA002)；青年教师成长计划项目(531107040602)作者简介：赵小英(1973-),女，湖南慈利人，湖南大学副教授摘要：AtWNK9为拟南芥WNK(Withnolysinekinase)激酶家族成员，其功能尚不清楚采用生物信息学和生物学实验相结合的方法，对AtWNK9蛋白结构、亚细胞定位、启动子元件、基因表达模式进行了分析研究发现，AtWNK9定位在细胞核中；该基因在拟南芥根中高效表达，其表达受ABA,NaCl、葡萄

2、糖、热和冷等非生物胁迫处理强烈诱导结果表明,AtWNK9为非生物胁迫反应相关基因，并可能参与根的生长发育关键词：基因表达；拟南芥；AtWNK9中图分类号：Q94文献标识码：AWNK激酶(Withnolysinekinase)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于蛋白激酶家族成员之一，因其家族成员在激酶功能域缺乏保守的赖氨酸而得名该激酶家族成员在通常保守的位于激酶区域第二个亚结构域缺乏一个赖氨酸残基，动物WNK激酶中赖氨酸被半胱氨酸所替代，在植物中常被天冬酰氨（N）或丝氨酸（S）替代，但激酶的生物活性没有发生变化，因此表明WNK激酶是一种特殊的蛋白激酶Na

3、kamichi等在双子叶植物拟南芥中克隆到植物中第一个WNK基因AtWNKl,随后又成功分离到了AtWNK2-98个WNK基因，并发现AtWNK2,AtWNK4,AtWNK6涉及拟南芥昼夜节律的调控过程AtWNK2,AtWNK5,AtWNK8的TDNA插入突变导致拟南芥早开花，AtWNKl的TDNA插入突变表现出了晚花的表型最新研究发现，破坏AtWNK8能提髙拟南芥对盐和渗透压力的抗性目前，在单子叶植物水稻中发现7个WNK基因,其中OsWNKl被发现参与各种非生物胁迫如冷、热、盐、干旱胁迫等Wang等在大豆中鉴定了一个根特异性的WNK同源基因,GmW

4、NK1,它通过与ABA分解代谢相关的蛋白GmCYP707A1相互作用微调ABA的水平，从而调控大豆晚期侧根的发育随后又发现GmWNK1能增强植物对NaCl和渗透压的抗性目前，有关拟南芥AtWNK9基因的功能尚处于未知状态，因此系统研究AtWNK9基因的功能对全面了解拟南芥WNK激酶的功能具有十分重要的意义生物信息学作为研究过程中的一项技术和开发工具在核酸及蛋白质序列分析及功能预测中发挥重要的作用基因蛋白结构与表达的生物信息学分析结果对后续基因功能研究有重要的指导意义本研究采用生物信息学和生物学实验相结合的手段，对AtWNK9蛋白结构、亚细胞以及基因表

5、达情况进行了分析，这将为进一步研究该基因的功能奠定基础1材料与方法11植物材料和载体拟南芥野生型Col4为哥伦比亚生态型，大肠杆菌DH5a菌株和pA7YFP载体均为本实验室保存12生物信息学分析运用简单模块构架搜索工具SMART(SimpleModularArchitectureResearchTool)(http://smartemblheidelbergde/smart/)和NCBI网站提供的保守结构域检索工具CDART(ConservedDomainArchitectureRetrievalTool)(http：//wwncbin1mnihgo

6、v/Strueture/)对AtWNK9蛋白进行保守结构域分析；利用丹麦科技大学(DTU)的CBS服务器上的NetPhos20Server程序(http：//mvcbsdtudk/services/NetPhos/)分析磷酸化位点；利用WoLFPSORT工具(http：//wolfsortseqcbrcjp)和TAIR网站中提供的蛋白亚细胞定位数据库SUBA(TheSubCellularProteomicDatabase)(http://suba2plantenergyuwaeduau/)预测蛋白质亚细胞定位［13-14］；通过TAIR网站中提供的

7、ArabidopsiseFPBrowser链接(http：//bbcbotanyutorontoca/efp/)分析AtWNK9基因的表达谱［15］利用植物PlantCARE在线分析工具(http://bioinformaticspsbugentbe/webtools/plantcare/)对AtWNK9基因上游1000bp的启动子顺式作用元件进行分析[16]1335S：:AtWNK9YFP融合表达载体构建以拟南芥野生型Col4为材料，采用RTPCR方法，首先提取总RNA并逆转录为cDNA,然后以此cDNA为模板，利用引物AtWNK9YFPF(ACG

8、CGTCGACATGATGAACAATCTCAGCCATCTT),AtWNK9YFPR(GGACTAGTGT