利用慢病毒介导的rnai技术沉默细胞中mkk6的研究

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1、摘耍摘要丝裂原活化蛋白激酶(mitogen．activatedproteinkinase，MAPK)信号通路是生物体内一个重要的信号转导通路，可以将多种细胞外刺激信号传递到细胞核内，在调节细胞生长、发育、分裂及凋亡中发挥了重要的作用。在哺乳动物细胞中，主要存在四个MAPK亚族，即细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38和ERK5。p38信号通路主要介导了细胞生长、分化和凋亡，在炎症及癌症的发生和发展过程中起了重要的作用。MKK6是p38的上游激酶，在受到致炎症细胞因子、生长因子和应急刺激的作用时会通过磷酸化p38而调控细胞发生反应。RNA干扰(RNAi)是

2、近些年来发现的一种重要的基因沉默技术，通过转录后的基因沉默方式(PTGs)来抑制相应基因的表达。在RNA干扰作用时，由21．23个碱基组成的小干扰RNA(siRNA)是关键的作用分子，siRNA可以特异性的结合靶基因的mRNA而导致相应mRNA的降解，最终导致靶基因表达水平的降低。RNAi对于研究基因的功能及信号转导通路具有重要的作用。目前，用于沉默基因表达的RNA干扰技术主要有化学合成的小干扰RNA(siRNA)、表达shRNA的质粒载体以及表达shRNA的病毒载体。质粒载体和病毒载体可以在宿主细胞内持续稳定的转录出shRNA，而shRNA可以被内源性的Dicer酶切割成siRNA双

3、链发挥RNAi作用。因此，与siRNA相比，质粒载体和病毒载体可以长时间、稳定的诱导基因沉默，在研究基因功能等方面具有更大的优势。慢病毒(1entivirus)是以人类免疫缺陷I型病毒(HIVI)为基础发展形成的一种病毒载体，对分裂细胞和非分裂的细胞(例如成熟的神经元)都具有很强的感染能力。由于慢病毒感染宿主细胞后，其基因可以高效的整合到宿主染色体中，因此可以在宿主细胞内持续稳定的表达外源基因。与包括腺病毒(adenovirus)和逆转录病毒(retrovirus)在内的其它病毒载体相比，慢病毒载体具有低免疫原性及基因整合率高等优点，因此广泛用于作为RNAi和基因表达的载体，可以在宿主

4、细胞内稳定的表达删A或目的基因。为了进一步研究MKK6基因的功能并明确人宫颈癌细胞中MKK6调控的信号通路，我们利用慢病毒RNAi系统沉默了Hela细胞中MKK6基因的表达。首先，利用shRNA设计软件和lnvitrogen慢病毒干扰系统说明书提供的shRNA设计规则设计了针对MKK6mRNA的一条shRNA片段。通过shRNA两侧的粘性末端与线性入门载体的粘性末端互补结合而将shRNA片段插入入门载体中。利用LR重组反应，将入门载体中的RNAi效应结构转移到表达载体中，然后利用阳离子脂质体转染的方法将表达载体及病毒包装复合体共转染到293FT生产者细胞中进行慢病毒的包装。同时，利用相

5、同的方法包装出表达LacZshRNA的慢病毒用于作为后续实验的阴性对照。在转染后48和72小时分别进行慢病毒的收集，然后对慢病毒进行滴度测定和浓缩。摘要用MKK6慢病毒和LacZ阴性对照慢病毒分别感染Hela细胞，然后利用Zeocin筛选出稳定整合慢病毒基因组的Hela细胞系。通过WesternBlot测定各细胞系中的MKK6表达水平，最终鉴定出MKK6基因沉默的细胞系。通过本研究，我们得出以下几点结论：1．成功改良了退火方法，发现梯度降温法可以有效的对合成的慢病毒RNAi双链进行退火。2．成功构建出慢病毒入门载体和表达载体，包装出高滴度的慢病毒并对慢病毒进行浓缩。3．改良慢病毒收集方

6、法，采用两阶段收集，提高了慢病毒的产量，并发现第二次收集的慢病毒滴度大概可以达到第一次的1／10。4．利用WesternBlot的方法检测了MKK6蛋白表达水平，在感染MKK6慢病毒的Hela细胞中MKK6表达水平明显降低，而感染LacZ阴性对照慢病毒的Hela细胞中MKK6表达水平没有发生明显变化。5．利用Zeocin抗性筛选的方法筛选出稳定整合MKK6慢病毒及LacZ慢病毒基因的Hela细胞系，为进一步研究MKK6调控的信号通路奠定了基础。关键词MKK6p38MAPK慢病毒RNAiAbstractAbstractMitogen-activatedproteinkinase(MAPK

7、)，ailimportantsignalingpathwayincells，couldtransducemultipleextracellularsignalsintothenuclei．Itplaysanimportantroleincellgrowth，development，differentiationandapoptosis．Inmammaliancells，therearefourmajorMAPKsubfamilies，i．e．，