慢病毒介导rnai沉默hoxb13基因对前列腺癌lncap细胞生物学行为影响地研究

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1、军医进修学院博士学位论文慢病毒介导的RNAi沉默HOXBl3基因对前列腺癌LNCap细胞生物学行为影响的研究中文摘要目的：前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，美国前列腺癌的发病率占男性恶性肿瘤首位，2008年新发病例占25％(186，320)，年死亡率占男性恶性肿瘤相关死亡总数的9％。在我国，前列腺癌的发病率呈迅速上升趋势。早期局限性前列腺癌一般采用手术或局部放疗，晚期首选方案是通过外科手术或药物达到去势目的。然而，最初对内分泌治疗敏感的前列腺癌患者后期会产生激素抵抗，进而出现转移。进一步深入研究前列腺癌的发生发展机制非常必要。ttOXBl3基因是同源盒基因中的一员

2、，在胚胎发育过程和肿瘤的发生发展阶段中其重要的作用，该基因在前列腺癌中的作用及功能有待进一步研究。RNAi是近年来新兴的用于基因抑制的生物技术，可用于基因组研究、信号传导等方面。本研究利用RNAi技术，构建HOXBl3shRNAi慢病毒表达载体，观察其对前列腺癌细胞株LNCap等生物学行为作用的影响。不仅充实HOXBl3基因的功能，也将在前列腺癌发病机制上有创新性发现。材料与方法：1．利用RNAi技术，设计合成针对HOXBl3基因的4条siRNA，连接到双酶切的tele-sh003质粒载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性茵落、扩增后提取质粒，进行DNA测序鉴定。重组慢病

3、毒表达载体质粒、慢病毒包装质粒(pRSV—Rev、pMDLg／pRRE、pMD2．G)按照一定比例混合，共同转染包装293FT细胞，收集、浓缩清液，得到病毒颗粒，用real-timePCR方法计算病毒颗粒的滴度。2、试验分HOXBl3RNAi感染组、HOXB3-neg组(空干扰组)和空白对照组。细胞计数法和MTT法检测细胞生长情况，Trnaswe11法检测LNcap细胞迁移能力变化。3军医进修学院博+学位论文3．经直肠超声引导下穿刺活检，收集前列腺癌组织及癌旁组织，提取RNA，逆转录为cDNA后，实时定量PCR法检测前列腺癌及癌旁组织中HOXBl3基因的表达；分析HOXBl

4、3基因与患者的生存PSA表达的相关性。结果：1．根据人HOXBl3基因序列，选择4个靶点，设计合成了4条寡核苷酸模板，成功构建了4条HOXBl3-shRNA慢病毒载体质粒，经测序鉴定插入片段序列与预期序列一致。293FT细胞包装构建成功重组质粒载体，生产出慢病毒颗粒，并进行浓缩。2．将HOXB3-shRNA转染前列腺癌细胞株LNCap，发现LNCap蛋白质表达显著降低，表明采用的干扰片段有效。HOXBl3沉默使前列腺LNCap细胞的生长加快和迁移细胞数目增加。3．HOXBl3基因在前列腺癌及癌旁组织中均有表达，癌组织Ct值高于癌旁组织。结论：成功构建了4条HOXBl3特异性

5、siRNA慢病毒表达载体。利用构建的重组慢病毒表达载体产生的慢病毒成功感染了前列腺癌细胞株LNCap，HOXBl3沉默使前列腺LNCap细胞的加快和迁移细胞数目增加。HOXBl3基因在前列腺癌及癌旁组织中的表达有差异。检：关键词：前列腺癌；HOXBl3基因；RNAi；慢病毒载体；经直肠超声前列腺穿刺活4军医进修学院博十学位论文Abstractobjective：Prostatecancer(Pea)isthemostcommoncancersofmen．Itaccountsforabout25％(186，320)ofincidentcasesinmen．Inourcount

6、ry,theincidentofPCahasbeenincreased．Intheearlystageofthisdisease，PCaistreatedbysurgeryorlocalraditiontheraphy．ThefirstchoicetotreatadvancedPCaissurgeryordurgtoachievecastration．However,sensitivitytohormonaltherapyinPCapatientshadbecomesteroid—dependent，evenmetastases．It’Sveryimporttodorese

7、archesonmechanisms。HOXB13geneisoneofhomeogene，anditplaysanimportantroleinthecourseofembryonicandtumordevelopment．TheroleandfunctionsofHOXB13geneinPCadevelopmentandcarcinogenesisneedtobefurtherstudies．Nowadays，thetechniqueofRNAibecomesanewheatedpointofgenethera