慢病毒介导的rnai抑制小鼠血管内皮细胞α1，3gt表达的研究

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1、学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：，幺斟日期：多萨了年y月弓口日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供

2、查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密r-q]。(请在以上方框内打“√”)作者签名：．磁叫．．日期：．。男年r月罗。日导师签名：日期：6孑年，肜。El天津医科大学硕士学位论文前言随着现代医学技术的进步，器官移植作为一种治疗终末期器官衰竭患者的方法，已经被证明是非常有效的，在临床上也得到了越来越广泛的应用。然而这也就使人类器官供体相对缺乏的状况越来越严重。为了克服这一不利状况，人们将目光重新投向了可能提供无限多量供体的异种移植。但是异种移

3、植与同种移植相比，会面临更为复杂的排斥反应，这就要求研究者们必须进行艰苦的探索。研究现状、成果异种移植面临的第一个障碍是超急性排斥反应(hyperacuterejection，HAR)。它发生于不同种系间的异种移植中，以血栓形成、出血及异种移植物破坏为特征，通常在移植物血管再通后数分钟至数小时发生。目前对HAR的发生机制已经有了比较清楚的认识，它的发生是由于人体内预存的异种反应性天然抗体(xenoreactivenaturalantibody，XNA)与异种器官血管内皮细胞表面的异种抗原结合从而引发补体系统的链式激活

4、所致。被天然抗体识别的异种抗原主要是GalQ(1,3)Gal，也称Gal表位。它表达于除旧世纪灵长类和人类外其它所有哺乳动物细胞的表面，本质是～组糖蛋白或糖脂类物质，由a1,3半乳糖基转移酶[a．1，3-galactosyltransferase(a1,3GT)]催化形成⋯。异种移植时，XNA与移植物内皮细胞表面的Gala(1，3)Gal结合后，补体系统被激活，形成膜攻击复合物，攻击移植物细胞膜，导致移植物间质出血、水肿、血栓形成，最终导致移植物在很短时间内失活坏死。研究者们对如何成功克服HAR进行了深入的研究，到目

5、前己发展出若干种方法。!tl：lBrandl等【2】用合成的可溶性aGalfE聚糖拮抗XNA的作用，Tanemura等Ⅲ用酶学竞争a1,3GT的作用，Liu等【4】用产气荚膜梭菌的13半乳糖苷酶C破坏GalQ(1,3)Gal，Zaidi等巧1利用转基因技术使供体表达受体的补体调节蛋白以抑制补体激活等，这些方法都能不同程度地减轻HAR，但并不能达到完全控带OHAR的目的，有些方法还仅能暂时减轻HAR。目前认为敲除Q1，3GT基因是控传,JHAR最为有效的方法，近年来，Lai㈤和Phelps‘73等报道他们成功培育出了a

6、l，3GT基因敲除猪，用基因敲除猪器官进行的异种移植实验也证明可以有效地克服HAR。然而，大型哺乳动物的基因敲除技术仍存在许多技术屏障，且费时多，天津医科大学硕士学位论文耗费大，成功率低，目前世界上仅有少数几家科研机构能拥有此项技术，这就使得研究者们为寻找快速、便捷的方法而努力。RNA干扰(RNAInterference，I矾Ai)是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制，与真核细胞中许多重要生物学过程密切相关，它由双链RNA介导，在转录后水平通过与mRNA特异性互补结合导致mRNA降解，从而导致序列特异性的转录后基

7、因沉默，且这种效应具有两个明显的特征，特异性和高效性。RNA干扰于1998年最先由Fire等人描述邛1，RNAi技术一经发现，就立即成为21世纪初生命科学研究中的焦点，在2001和2002年连续两年被((Science))杂志评为自然科学十大突破之一。作为一项高效率高特异性的基因封闭技术，RNAi近年来已成为分子生物学研究的主要技术手段之一，在基因功能研究、基因治疗、基因表达调控等方面有着非常重要的应用吟1。RNAi的实现方法有很多，如直接转染合成的siRNA、’利用质粒载体或病毒载体等。直接转染法细胞内的siRNA

8、很容易被降解，质粒载体能在细胞内长时间、稳定地生成siRNA，但其转染哺乳动物细胞的效率还是无法令人满意，特别是不能转染非分裂相细胞。病毒载体，特别是慢病毒载体，免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞，能将自身携带片断整合入宿主细胞基因组，能在哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA，长期抑制基因表达n们，是实现RNAi比较理想的载体。研究目的、方法