pparγ在结缔组织病相关肺间质病变中抗纤维化作用的研究

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1、I唧I咖帆删咖删哪呲眦必Y2406160硕士学位论文PPAR7在结缔组织病相关的肺间质病变中抗纤维化作用研究指导教师：张晓教授研究生：潘晓娟摘要研究背景结缔组织病(connectivetissuedisease，CTD)累及肺部的病变多种多样，表现为气道、肺间质、肺实质、血管系统及胸膜等部位病变，其中间质性肺疾病(interstitiallungdisease，ILD)是CTD累及肺部的主要并发症，又称弥漫性实质性肺疾病，具有相似的影像学、病理学及临床表现的肺功能紊乱性疾病。有文献报道CTD患者ILD发病率达25％，而10年生存率仅为60％

2、，虽然不同文献报道发病率及病死率不同，但总体差异不大。CTD．ILD的治疗目前多使用激素及免疫抑制剂治疗，但总体治疗效果不佳且药物不良反应限制其长期应用。因此迫切需要我们深入了解CTD．ILD发病机制，以便寻求确切有效的治疗方法。ILD主要病理变化是肺泡慢性炎症、间质细胞过度增生及细胞外基质过度沉积。在纤维变性过程中存在大量促炎和促纤维化细胞因子参与，其中转化生长因子(transforminggrowthfactor131，TGFl31)能,介导成纤维细胞的趋化、增殖及分化，促进细胞外基质合成、聚集及减少细胞外基质降解等效应，被认为是肺纤维

3、化过程最关键细胞因子。而且我们前期实验已经证实CTD．ILD患者肺组织中TGFl31的表达增加，因此阻断TGFl31效应可能改善组织纤维化程度，达到抗纤维化效应。近年来体内外实验研究证实过氧化物酶体增殖物激活受体1，(peroxisomeproliferatorsactivatedreceptorgamma，PPARr)的配体能通过干扰TGFe)I效应改善肺纤维化程度，但PPAR7干扰TGFpI效应的具体机制仍不明确，中文摘要可能是通过影响Smad复合物核内聚集、Smad2／3蛋白的蛋白后修饰及竞争辅活化因子或转录复合物与靶基因的结合，达到

4、干扰TGFl31促纤维化效应。本研究拟通过了解PPAIq配体罗格列酮对TGFl31诱导的肺成纤维细胞的影响，观察0【-SMA蛋白，I型胶原和CTGFmRNA，乙酰化Smd3变化，初步探讨罗格列酮抗肺纤维化作用及可能机制。研究目的1．通过收集CT引导下肺穿刺病人的标本，了解PPAR丫在CTD．ILD患者肺组织的表达水平。2．原代培养人肺成纤维细胞，通过体外实验了解TGF[31对人肺成纤维细胞分化的影响及PPAR"f配体罗格列酮对TGFl31诱导细胞分化是否存在抑制效应。3．通过体外实验，探讨PPART配体对TGFl31诱导细胞分化影响的机制是

5、否是通过与Smad3竞争结合P300实现的。研究意义．通过以上研究，探讨是否由于CTD．ILD患者肺组织中PPA脚表达降低，导致肺纤维化发生发展，了解PPAR丫配体罗格列酮是否能通过干扰TGFIBl效应实现抗纤维化作用，这种干扰效应是否是通过与Smad3竞争结合P300，进而影响Smad3乙酰化，从而为CTD．ILD的基础研究提供一些理论依据，为CTD．ILD的治疗提供新的靶点。资料与方法1．1研究对象与纳入标准收集2001．2010年在广东省人民医院风湿免疫科就诊的CTD．ILD行CT引导下细针穿刺肺活检术患者37例，女性29例，男性8例

6、，平均年龄47．36+2．24岁，其中SSc6例，SLE5例，pSS5例，PM／DM10例，RA3例，血管炎4例，MCTD4例。选取20例不吸烟并无感染的肺癌患者远离癌旁的正常肺组织作为对照组，其中女性12例，男性8例，平均年龄45．62+1．12岁。实验组和对照组年龄及性别差异无统计学意义。硕士学位论文CTD．ILD纳入标准：至少符合以下条件的中的①+⑤。①符合各类结缔组织病国际通用标准的诊断标准；②有咳嗽、咳痰、胸闷、胸痛及气促等呼吸道表现，排除阻塞性通气障碍者；③肺功能：限制性通气功能障碍、气体弥散功能降低；④影像学改变：高分辨率CT

7、(HRCT)检查显示磨玻璃样、网格样、蜂窝样、纤维条索状影及囊性变等；⑤肺活检病理表现：符合2002年美国胸科学会与欧洲呼吸学会(ATS／ERS)制订病理表现，并排除妊娠、感染、药物、肿瘤及吸烟等因素。该研究得到当地伦理委员会批准，且取得所有参与者的知情同意。1．2实验方法1．2．1免疫组织化学检测肺组织中PPAR丫表达：37例CTD．ILD和20例对照组肺组织，石蜡包埋肺组织，免疫组织化学染色。脱蜡至水后，用3％双氧水作用15min以阻断内源性过氧化物酶活性，1％TritonX．100透化细胞膜10min，兔抗人PPAR7单克隆抗体(CS

8、T1：200)，室温孵育60min，辣根酶标记抗兔二抗(基因公司)室温孵育30min，二氨基联苯氨(DAB)显色，苏木素复染。阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。随机选取5